榄绿粗叶木粗多糖提取工艺及对H22肝癌细胞毒性影响

梁青龙，郭婷婷，温扬敏

泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州 362011

榄绿粗叶木粗多糖提取工艺及对H22肝癌细胞毒性影响

梁青龙，郭婷婷，温扬敏

泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州 362011

目的 研究榄绿粗叶木多糖提取工艺优化及对H22肝癌细胞增殖抑制效果。方法 2016年2—5月从福建宁化泥坑村采集榄绿粗叶木粗，在单因素分析的基础上，设计3因素3水平正交实验优化榄绿粗叶木粗多糖提取工艺。并采用MTT法测定榄绿粗叶木粗多糖对H22肝癌细胞增殖抑制效果。 结果 影响榄绿粗叶木粗多糖提取的首要因素是固液比，其次是水浴时间和温度。粗多糖最佳提取条件为：温度70℃、时间12 h、固液比为1∶15 (A2B2C3)。粗多糖对H22肝癌细胞具有一定增殖抑制活性，抑制效果随粗多糖浓度增大而增加。 结论 水提醇沉淀法榄绿粗叶木多糖提取有效方法，榄绿粗叶木多糖具有抑制肿瘤细胞增殖作用。

粗多糖；提取工艺；正交试验；肝癌

1 资料与方法

1.1 实验材料与试剂

榄绿粗叶木由福建宁化泥坑村采撷，经过泉州林业局林彦云先生鉴定；氯仿、无水乙醇、硫酸和正丁醇等蒽酮和葡萄糖，肝癌细胞株、胎牛血清、培养基、MTT试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 温度对粗多糖提取率的影响 将榄绿粗叶木根用刀切成长约2～3 cm，宽约0.5～1 cm小块。称取50 g，放入1 000 mL三角瓶，再加入固液比(g/mL)为1∶10去离子水。分别放到40、50、60、70、80℃的水浴锅中水浴8 h后，用定性滤纸对上清液进行过滤，滤液再用Sevag法除去蛋白后，用终浓度为80%乙醇溶解，4℃过夜沉淀。冷冻干燥得到粗多糖粉末，每组实验设3个平行。

1.2.2 固液比对粗多糖提取率的影响 称取榄绿粗叶木根50 g，分别加入固液比(g/mL)为1:4、1:8、1:12、1: 16、1:20去离子水。于50℃水浴锅中水浴8 h，每组实验设3个平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.2.3 时间对粗多糖提取率的影响 称取榄绿粗叶木根50 g，分别加入固液比(g/mL)为1:12去离子水。于50℃水浴锅中水浴3、6、12、24、36 h，每组实验设3个平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.3.4 正交试验优化粗多糖提取工艺 采用L9(34)正交进行正交试验优化多糖提取工艺，实验因素及水平见表1。

表1 实验因素与水平

1.3.5 粗多糖测定 粗多糖含量的测定应用蒽酮比色法[5]。标准曲线方程：y=0.5934x+0.4321，R2=0.9997。粗多糖提取率(%)=（粗多糖质量/根质量）×100%。

1.3.6 榄绿粗叶木粗多糖对H22肝癌细胞增殖抑制实验 H22肝癌细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，取对数生长期细胞，分装于96孔板，每孔100 μL调节细胞密度约为6 000个细胞每孔。每孔分别加入终浓度为0（空白对照组）、0.5，1.0、2.0、4.0 mg/mL的粗多糖。于5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养24、48、72 h后，采用MTT法分别测定细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组吸光度/空白对照组吸光度)×100%

2 结果与分析

2.1 温度对粗多糖提取率的影响

随着温度增加，榄绿粗叶木粗多糖提取率增大（见图1）。当温度达到60℃以上时，粗多糖提取率趋于稳定。与温度为30℃比较，在60、70、80℃条件下粗多糖提取率均差异有统计学意义(P＜0.05)。而60、70、80℃条件下，各组粗多糖提取率差异无统计学意义(P＞0.05)。表明60、70、80℃条件下，粗多糖提取率较高且比较稳定。

图1 温度对粗多糖提取率的影响

2.2 固液比对粗多糖提取率的影响

固液比小于1:12 mg/mL时，随水量增加，粗多糖提取率迅速增大。而当固液比达到1∶12 mg/mL时，固液比继续增加榄绿粗叶木粗多糖的提取率无显著增加（图2）。考虑到水量大，后续蒸发时间过长，耗时费力，且可能破坏粗多糖，所以选择固液比1:12 mg/mL比较合适。

图2 固液比对粗多糖提取率的影响

2.3 时间对粗多糖提取率的影响

水浴时间＞24 h时，榄绿粗叶木粗多糖提取率随时间增加而增大，水浴时间24 h时提取率最大（图3）。与水浴时间24 h比较，水浴3 h和6 h实验组粗多糖提取率差异有统计学意义(P＜0.05)，而水浴12 h和36 h实验组粗多糖提取率差异无统计学意义。显示继续延长处理时间对粗多糖提取率无显著影响。

图3 时间对多糖提取率的影响

2.4 正交实验优化粗多糖提取工艺

表2 正交实验结果

以粗多糖提取率为指标，采用3因素3水平正交实验对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺进行优化，结果见表1。直观分析显示影响粗多糖提取的主次顺序依次为：固液比、水浴时间和水浴温度(C＞B＞A)。方差分析(表2)显示，固液比对榄绿粗叶木粗多糖提取率差异有统计学意义(P＜0.05)，而温度和时间对榄绿粗叶木粗多糖提取率差异有高度统计学意义(0.15＜P＜0.01)。综合考虑榄绿粗叶木粗多糖提取最佳工艺是温度70℃、时间12 h、固液比为1∶15(A2B2C3)。见表3。

表3 粗多糖提取的正交实验方差分析

2.5 粗多糖对肝癌细胞毒性作用

榄绿粗叶木粗多糖对H22肝癌细增殖抑制作用见图4，培养24 h后，不同粗多糖浓度对H22肝癌细抑制差异无统计学意义（P＞0.05）。细胞培养48 h和96 h，肿瘤细胞的生长抑制率显著增加，且随粗多糖浓度增大而增加。

图4 多糖对H22肝癌增殖抑制率的影响

3 讨论

分离及纯化是研究多糖功能及性质的前提，水提醇沉淀法是粗多糖提取最原始且应用最广泛的方法。其原理是利用粗多糖不溶于有机溶剂，在粗多糖提取水溶液中加入高浓度乙醇等使粗多糖沉淀析出，从而达到初步分离的目的[6]。该方法具有简单、经济、条件温和不会破坏粗多糖等特点，已广泛应用于多糖提取。张国华等[7]以多糖提取率为指标，采用正交试验研

究冬虫夏草多糖的提取工艺。结果显示加水量10：1，时间0.5 h，提取3次时提取率最高。乙醇浓度67%时多糖沉淀效果最佳。提示影响粗多糖提取的主要因素包括提取时间、温度、固液比及pH值等，通过优化提取工艺提高粗多糖提取率是的主要手段之一。罗忠圣等[8]研究水提醇沉淀对中药复方二岩虎果汤的提取工艺，显示最佳提取条件为10倍量水，提取1次，1 h/次，表明该方法稳定可行,且不影响药效。该研究通过对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺进行优化，可较大程度提高粗粗多糖提取率。其中正交试验最佳提取率（A2B3C3）粗多糖提取率达1.77%，比最低提取率（A1B1C1）粗多糖提取率达1.15%提高了53.91%。

肿瘤已成为导致人类死亡的主要疾病之一，随着癌症诊断和治疗技术的改善和癌症患者成活率不断提高[9]。并由于现代人们不良生活习惯，环境污染因素影响以及人口增长及老龄化等原因，全球癌症幸存者的数量越来越多[10]。在肿瘤的治疗和预防中，药物占有不可替代的地位。天然抗肿瘤活性成分也是合成化学类抗肿瘤药物的先导化合物。天然药物一直是人类获得药物的主要途径，时至今日天然药物仍是活性成分或先导化合物发现的重要途径[11]。植物多糖可通过增强机体免疫活性、诱导肿瘤细胞分化与等发挥抗肿瘤作用。从香菇分离的多糖已应用到抗肿瘤的临床治疗，香菇多糖能极显著增高NK细胞活性，提高血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的含量，并通过调节免疫系统而达到良好抗肿瘤效果[12]。朱坤杰等[13]从库拉索芦荟多糖和木立芦荟中提取多糖，显示不同剂量的库拉索芦荟多糖和木立芦荟多糖均具有一定肿瘤抑制活性，其中高剂量组抑制率达45.45%和46.89%。另外，还能恢复荷瘤机体免疫功能紊乱，特别是增加脾脏的免疫功能而发挥抗肿瘤作用。此外，肖佩玉等[14]研究表明枸杞多糖也改善荷瘤小鼠免疫活性而抑制小鼠H22肝癌细胞生长。给药10 d后可见肿瘤减小，AFP、CEA、TNF-α含量降低，而NK细胞活性增强。实验表明，榄绿粗叶木提取物具有抗氧化、抗菌、抑制食管癌细胞等活性。显示榄绿粗叶木多糖对H22肝癌细胞具有较强体外抑制活性，细胞培养48 h后，不同浓度粗多糖对H22肝癌细胞增殖均具有一定抑制作用，且抑制率随粗多糖浓度增加而增大。

[1]申利红,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及应用进展[J].中国农学通报,2011,27(2):349-352.

[2]朱华.东亚粗叶木属(茜草科)植物的分布及其生物地理意义[J].云南植物研究,2008,30(3):308-314.

[3]国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999:446.

[4]李斌，张东明，罗永明.长尾粗叶木根化学成分的研究[J].中国中药杂志，2006，31（2）:133-135.

[5]程知庆,沈和定,姚理想,等.贝类多糖的生物活性研究现状及其药用价值[J].安徽农业科学,2015(24):17-19.

[6]杜景东,田凤娟,陈培雄,等.云雾绿茶多糖提取方法的优化及Sevage法除蛋白的工艺研究[J].中南药学,2015 (12):1281-1283.

[7]张国华,李绍平,季晖,等.正交设计优化冬虫夏草多糖的提取工艺[J].安徽医药,2004,8(6):404-405.

[8]罗忠圣,钱志瑶,周镁,等.正交试验优选二岩虎果汤的水提醇沉工艺[J].中成药,2016,38(1):193-197.

[9]Allemani C,Weir H K,Carreira H,et al.Global surveillance of cancer survival 1995-2009:analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries(CONCORD-2)[J].Lancet,2015, 385(9972):977-1010.

[10]Miller K D,Siegel R L,Chun Chieh Lin PhD MBA,et al.Cancer treatment and survivorship statistics,2016[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(4):271-289. [11]Vincent T.DeVita,Jr.,M.D.,et al.Two Hundred Years of Cancer Research[J].The New England Journal of Medicine, 2012，366（23）,2207-2214.

[12]Schepetkin I A,Quinn M T.Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential [J].International Immunopharmacology,2006,6(3):317-333.

[13]朱坤杰,宋娟,沈云虹,等.库拉索芦荟多糖和木立芦荟多糖体内抗肿瘤作用[J].中成药,2010,32(11):1978-1980.

[14]肖佩玉,万正兰,黄际薇.枸杞多糖对肝癌模型小鼠肿瘤抑制与免疫功能的影响[J].中国药房,2014,25(43)：4046-4048.

Extraction of Crude Polysaccharides from L.lancilimbus and Inhibition of Hepatoma Cell Lines H22 in Vitro

LIANG Qing-long，GUO Ting-ting，WEN Yang-min
Department of Basic Medical Sciences,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province，362011 Chinia

Objective Extraction technology and inhibition of Hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides from L.lancilimbus were researched.Methods L.lancilimbus were collected from Nikeng village,Ninghua country,Fujian provience from February to May in 2016.Orthogonal experiment was applied to obtain the optimum extraction condition on the base of single factor experiment.the inhibitions of hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides were measured by MTT assay.Results The main factor affecting extracting rate of polysaccharides was solid-liquid ratio,followed by treated time and temperature.The optimum extraction conditions to obtain the highest polysaccharides were 70℃,12 h and solid-liquid ratio of 1∶15.polysaccharides from L.lancilimbus could inhibit cell proliferation of hepatoma cell Lines H22 in Vitro,and the inhibition rate increased with the polysaccharides concentration.Conclusion Water extracting-ethanol precipitation method were applicable for extraction crude polysaccharides from L.lancilimbus,and the polysaccharides can inhibit cell proliferation of gastric cancer cell in Vitro.

Crude Polysaccharides;Extraction technology;Orthogonal test;Hepatoma

R284.2

A

2096-1782（2016）11－0114-04

泉州市科技计划项目（2012Z76)。

梁青龙（1958.11-），男，福建泉州人，本科，副教授，研究方向：生理学。

2016-08-15）

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.11.114

植物多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种生物活性，且兼有较小毒副作用和体内无残留等优点[1]。植物多糖的开发与利用已越来越受关注。榄绿粗叶木(Lasianthus lancilimbus,Merr.)属于茜草科（Rubia cordifolia L.）、粗叶木属（Lasianthus Jack,nom.cons.）的一个变种[2]。传统中医实践表明粗叶木属植物具有治疗筋骨疼痛，活血止痛等作用，民间还将其用于治

湿热黄疸等[3]。应用现代分离纯化技术，已从粗叶木属中的长尾粗叶木[4]等中获得多种具有确定生理活性的单体物质，而有关榄绿粗叶木药理开发研究较少。该文于2016年2—5月对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺优化及对H22肝癌细胞增殖抑制作用进行研究，为榄绿粗叶木植物的医药价值研究提供基础。