桔小实蝇雌雄虫对18种寄主挥发物的触角电位差异比较

谭 静，陈 玲，李红亮*，王 强，商晗武*

（1.中国计量学院 生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021）

桔小实蝇雌雄虫对18种寄主挥发物的触角电位差异比较

谭 静1，陈 玲1，李红亮1*，王 强2，商晗武1*

（1.中国计量学院 生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021）

桔小实蝇 （Bactroceradorsalis）是一种重要的检疫性害虫，其雌虫经常选择多种水果果实进行产卵和为害，因此这些寄主水果的挥发物很有可能是引诱桔小实蝇雌虫的嗅觉信息。为了系统研究不同寄主水果挥发物对桔小实蝇雌雄虫的嗅觉反应差异，本研究从8种寄主中选择18种常见的植物挥发物，分别对其雌雄进行触角电位 （EAG）测试。结果显示，雌雄成虫个体之间有11种无显著性差异，其他7种雌雄之间均呈极显著性差异 （P＜0.01）。其中，雌虫对反-2-己烯醛、苯甲醛和3，4二甲基苯甲醛等3种，雄虫对乙醛和水杨酸甲酯等2种具有较强的EAG反应 （均＞300mV）。另外发现，雌雄成虫对于供试的醛类、酯类和酮类的平均反应值均较醇类和萜烯类的平均反应值强 （P＜0.01），而雌雄之间除醛类外，其他类别挥发物并无差异。表明桔小实蝇雌雄成虫对植物的嗅觉选择性和敏感性存在着明显的差异，同时在挥发物类别上也有一定的相似性。

桔小实蝇；寄主挥发物；触角电位；雌雄比较

桔小实蝇（Bactroceradorsalis）是一种重要的检疫性害虫，与多数寄生害虫嗜好植物茎叶不同，桔小实蝇主要以香蕉、柑橘和芒果等多种果实作为寄主，其为害方式主要是以雌虫产卵于果皮下，幼虫取食果肉，从而导致果实腐烂或未熟先黄而落，是生产中最重要的寄生害虫之一［1］。目前对桔小实蝇的综合防治过程中，主要防治措施有物理防治、化学农药防治、性诱灭雄、食物诱杀和生物防治 （释放不育雄虫和寄生蜂）等，其中诱剂诱杀是一种既有效又环保的防治措施，但目前采用的甲基丁香酚仅引诱雄虫，对雌虫的引诱作用有限［2］，而单纯的雄虫引诱难以达到预期的防治效果。所以基于寄主植物挥发物，开发和设计包括针对桔小实蝇雌虫的新型气味引诱剂已成为一种新的研究思路。

昆虫可以对来自外界环境中的各种气味物质进行嗅觉感知和精确识别，这在昆虫进行寄主选择、觅偶、产卵地选择等行为中具有重要意义［3］。昆虫对其寄主植物挥发物的嗅觉识别均主要依赖于触角上密布的嗅觉感受器来完成的，而这些感受器能够对某些气味产生电信号冲动，基于此，Schneider［4］于1957年建立了一种方法，即利用电极和电流放大仪来记录昆虫触角化学感受器对信息素的电信号的总体反应，即触角电位（Electroantennogram，EAG）技术。EAG技术目前在昆虫嗅觉电生理研究方面已经成为不可缺少的手段，也是化学生态学中最常用、最重要的电生理技术之一［5］，EAG技术能反应昆虫触角上所有感受器对气味反应的整体活性情况，并能快速地推测昆虫嗅觉对某种气味是否产生活性和敏感性［6］。这对于开发和设计害虫的嗅觉引诱等功能具有重要的理论意义。

目前，已经有许多关于EAG用于桔小实蝇嗅觉反应的报道，如对性诱剂［7］、啤酒废酵母酶解液［8］、矿物油乳化后的香蕉提取物［9］、木瓜挥发物［10］以及7种寄主挥发物作为嗅觉 EAG测试［11］等，但上述研究采用的桔小实蝇主要的寄主挥发物较为单一或数量有限。因此本研究经文献查阅并确立8种寄主18种常见的寄主植物气味挥发物 （表1），比较研究了桔小实蝇雌雄虫对候选气味的EAG活性，这不仅充实了桔小实蝇嗅觉生理功能研究理论基础，为进一步筛选对桔小实蝇雌雄虫具有引诱活性的气味物质提供了理论依据。

表1 桔小实蝇部分主要寄主挥发物的成分及相对含量

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

桔小实蝇为本实验室内人工饲养的种群。饲养条件为：温度 （26±1）℃，相对湿度 （75±5）%，光周期L∶D为12∶12（光12h，暗12h）。待其化蛹、羽化后，收集性成熟时期的雌虫进行试验，试验前饥饿3h。

1.2 试验仪器和试剂

触角电位仪 （荷兰Syntech公司），由智能化数据获取控制器 IDAC-2、刺激气流控制器（SyntechCS-55）、微动操作仪（SyntechMN-151）及Syntech软件处理系统4部分组成。

根据相关文献报道，确定供试的各种寄主挥发物 （表1），所有挥发物的化学标准品，均购自百灵威科技有限公司。其他耗材，如导电胶，手术刀，刀片，锡箔纸及定性滤纸等均为国产。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂及刺激样品的制备

分别将每种化合物溶于液体石蜡，并配成0.1（V/V）溶液进行EAG测定。剂量反应测试时，选择荧光结合试验中具有代表性的化合物，用溶剂作为对照。

1.3.2 触角电位测定

首先用手术刀将桔小实蝇触角从基部切下，然后小心地将桔小实蝇触角的两端用导电胶分别黏在EAG的金属电极上。这时观察显示屏上的基线变化情况，等到基线平稳以后，便可以开始试验。

在滤纸条上（2cm×0.5cm）滴加10μL待测样品溶液，使溶剂挥发一会后，再将滤纸塞进巴斯德管内，用锡箔纸把管口两端封住，防止样品挥发。另取10μL液体石蜡+滤纸作为空白对照。测试时将巴斯德管一端插入送气管外侧直径为2mm的小孔内，送气管管口与触角纵向垂直，并与触角相距1cm左右。同时点击手标和踩脚踏板，刺激时间0.2s，刺激气流为100mL·min-1，2次刺激时间相隔2min，以保证触角感觉器的感觉功能完全恢复。

随机测定待测样品。由于随着时间的延长，触角的生理活性也会跟着降低，为避免此种情况对试验造成不利的影响，以0.01（V/V）的叶醇 （溶剂为液体石蜡）作为标准参照刺激对各测试样品的刺激反应进行标准化校正。因为通过预试验发现，桔小实蝇对叶醇的反应存在稳定的峰值，所以选择叶醇作为标准参照。在测定样品前先进行1次对照CK（液体石蜡）和标准参照刺激，然后测试5个样品，再进行对照和标准参照刺激，如此循环往复，每个触角约测试5个样品，每个待测样品重复6次，EAG反应值参照［20］的方法计算。

1.3.3 数据统计方法

利用SPSS16.0软件对雌雄虫分别对所有挥发物的EAG反应的相对值采用单因素方差检验（P＜0.05）分析，LSD法两两比；雌雄虫对某一种或某一类的挥发物之间的比较采用t检验分析。所有结果最后用Origin8.0软件进行数据处理和显示。

2 结果与分析

2.1 桔小实蝇雌雄虫对寄主挥发物EAG反应的差异比较

为了比较18种寄主植物挥发物对桔小实蝇雌雄成虫的EAG反应值，按照雌虫EAG反应值从大到小排列，并对同一挥发物的雌雄EAG数据进行方差分析。结果如图1所示，经t检测分析，桔小实蝇雌雄成虫个体之间对18种挥发物中的11种（61.1%）没有体现显著性差异，这表明大多数供试植物挥发物引发的桔小实蝇EAG反应与其性别关系不大。而其他7种挥发物均呈极显著性差异，如雌虫对反-2-己烯醛 （雌/雄）为 （600.95± 50.83）mV/（42.18±7.13）mV、苯甲醛 （雌/雄）为 （434.63±53.1）mV/（196.08±9.63）mV、3，4-二甲基苯甲醛 （雌/雄）为 （295.69± 25.19）mV/（42.18±7.13）mV、丁酸丁酯 （雌/雄）为 （242.57±30.57）mV/（132.08±18.33）mV和顺-3-己烯乙酸酯 （雌/雄）为 （132.32± 12.8）mV/（34.5±11.7）mV等5种气味的EAG反应较雄虫强 （P＜0.01，**）；而雄虫对水杨酸甲酯 （雌/雄）为 （49.17±9.11）mV/（347.26± 51.52）mV和乙醛 （雌/雄）为 （88.91±6.34）mV/（326.07±55.15）mV等2种气味的EAG反应较雌虫强。这表明对于某些植物挥发物，桔小实蝇雌、雄虫可能具备独特的嗅觉感受和分辨能力。

图1 桔小实蝇雌雄成虫对18种挥发物的EAG反应值比较

2.2 桔小实蝇雌雄虫对各类气味挥发物的EAG反应比较

将18种桔小实蝇寄主挥发物按照化合物类型分成5类，并对雌雄分别对各类的EAG反应分别进行单因素方差分析。图2显示，桔小实蝇雌虫对酯类、醛类以及酮类三者反应较强。其中，醛类的整体反应最强 （反应值 ＞250mV），其次为酮类（反应值＞180mV）和酯类 （反应值 ＞140mV），这三类之间均存在显著差异；对醇类和萜烯类的反应最弱，经方差分析，这2类挥发物与前3种挥发物存在显著差异。桔小实蝇雄虫对酯类、醛类以及酮类三者反应较强。其中，酯类反应最强 （反应值＞150mV），但比较结果显示，3类物质的反应差异不显著。雄虫同样对醇类和萜烯类的反应最弱，方差分析表明，这2类挥发物与前3种挥发物也存在显著差异。

同一类挥发物雌雄进行比较 （图2）可知，雌虫对醛类的敏感性极显著高于雄虫，而雌雄虫对其他类型的挥发物并未表现出显著差异。此外，桔小实蝇无论雌雄对供试的醛类、酯类和酮类的平均反应值均比醇类和萜烯类的平均反应值 （反应值均＜100mV）强，且达到极显著水平，而雌雄之间却不显著。这也表明桔小实蝇对某些挥发物存在着较为明显的敏感性或选择性，而这种性质与性别之间可能并无直接关联。

图2 桔小实蝇雌雄成虫对5类挥发物的EAG反应值比较

3 讨论

在开展对实蝇防治研究的过程中，除了易对环境造成污染的化学防治外，以性诱剂为代表的化学生态防治技术在桔小实蝇防治过程中具有重要的体现［21］。但取食少量的诱剂可大幅提高正常雄虫和不育雄虫的交配竞争能力及对雌性的吸引力，但经过一段时间的亚剂量的性诱剂处理后，桔小实蝇当代和后代雄性对性诱剂的趋性下降［22］。而EAG数据也显示，雌雄虫对甲基丁香酚等性诱剂的反应一般［11］。由于植食性昆虫对其嗜好寄主植物的气味选择有明显的倾向性［23］，故利用桔小实蝇寄主水果挥发性物开发食物源诱剂成为生物统合防治的重要策略。但由于桔小实蝇寄主果实很多，且每种寄主所含的植物挥发性物质的种类和含量又各有所异，因此，本研究前期筛选出几种重要的寄主果实及其挥发物种类和含量，并利用EAG技术比较桔小实蝇雌雄虫对18种寄主植物挥发物的嗅觉反应，通过对雌雄个体间的EAG反应进行比较发现，雌雄成虫个体间对18种挥发物中的11种 （61.1%）并未表现显著性差异，这表明大多数供试植物挥发物引发的桔小实蝇EAG反应与性别关系不大。

其他7种挥发物雌雄之间均呈极显著性差异。如桔小实蝇雌虫对反-2-己烯醛、苯甲醛和3，4二甲基苯甲醛等3种气味分子具有显著的EAG反应，而雄虫对乙醛和水杨酸甲酯具有较灵敏的EAG反应。这表明桔小实蝇雌雄虫对于某些植物挥发物可能具备独特的嗅觉感受和分辨能力。这可能是由于昆虫的雌、雄虫在整个种群的生存和繁衍中承担的责任不同，所以导致对植物气味的反应上也经常存在着性别的差异［24］。如茶小卷夜蛾对6种寄主植物的EAG数据表明，雌虫对寄主植物如苹果叶、茎和果反应较大，而雄虫则无反应［25］；而绿盲蝽的EAG反应表明，雄虫对性信息素比雌虫更敏感，而雌虫则趋向于植物挥发物［26］。这可能是因为雌虫要选择合适的寄主植物进行产卵，所以雌雄成虫间的嗅觉对植物的选择性和敏感性存在着明显差异。雌虫在繁衍后代中需要寻找寄主植物产卵，而雄虫则是寻找交配对象，昆虫的不同性别对于不同挥发性物质的反应，是否是雌雄虫分工长期对生态的适应结果。

具体来看，在醛类化合物中，桔小实蝇雌蝇对反-2-己烯醛的反应最强，其次为苯甲醛，而雄虫对这2种挥发物的反应并不强，雌雄均达极显著差异。而其中反-2己烯醛和苯甲醛分别在芒果皮和哈密瓜中含量最高，在柑橘［12］也均有分布，由于桔小实蝇成虫对成熟芒果果肉挥发物能够对桔小实蝇的雌雄虫均有显著的引诱作用［27］，而芒果成熟度越高，对雌虫引诱效果越强［28］，这说明桔小实蝇雌虫有可能是由于对这2种醛类有较强的嗅觉敏感性而对成熟芒果具有明显的趋性。此外通过对桔小实蝇普通气味结合蛋白2的体外功能验证，发现其均能够与反 2-己烯醛和苯甲醛有较强结合［29］。这从分子层面说明了这些挥发物也参与桔小实蝇的嗅觉识别过程。因此，这些挥发物有可能在雌蝇引诱剂设计和筛选方面发挥作用。对于烯烃，研究显示，桔小实蝇雌雄成虫对包括α-蒎烯和3-蒈烯等芒果气味挥发性物质的嗅觉行为反应均无显著性差异，同时也均没有明显的行为定向反应［30］。这与本研究中EAG的结果非常吻合，即雌雄成虫对2种萜烯类物质的EAG反应也无显著差异，同时也是所有测试挥发物中最弱的。

从相似点上看，桔小实蝇无论雌雄，二者对于供试的醛类、酯类和酮类的平均反应值，均要比醇类和萜烯类的平均反应值 （反应值均 ＜100mV）强，且达到极显著水平，而雌雄之间却不显著，这也表明桔小实蝇对某些挥发物存在着较为明显的敏感性或选择性，而这种性质和性别并无直接关联。这体现了雌雄虫不仅对敏感类型挥发物的类别不同，对最敏感型的反应值也存在差别。此外，水杨酸甲酯和乙醛能引起桔小实蝇雄虫触角强烈电生理反应，这也暗示2种挥发物可能与桔小实蝇雄虫性吸引有关，这与甲基丁香酚非常相似［7］，而这2种挥发物是否能引起雄虫趋性还需要进一步的行为学研究。

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（责任编辑：张瑞麟）

S436.619

A

0528-9017（2016）05-0677-05

文献著录格式：谭静，陈玲，李红亮，等.桔小实蝇雌雄虫对18种寄主挥发物的触角电位差异比较 ［J］.浙江农业科学，2016，57（5）：677-681.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160520

2016-01-20

浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地开放基金 （2010DS700124-KF1209）；农业部农药残留检测重点实验室开放基金 （2012PRG02）

谭 静 （1990—），女，山东威海人，在读硕士，研究方向为农业昆虫学。

李红亮，博士，副教授，主要从事昆虫嗅觉生理生化工作，E-mail：atcjlu@126.com。商晗武，博士，研究员，从事农业昆虫与害虫防治工作，E-mail：hwshang@cjlu.edu.cn。