来源于不同品种鱿鱼硫酸软骨素理化性质比较

李燕妮,郭 琳,许维娜

(滨州医学院葡萄酒学院,山东烟台 264003)



来源于不同品种鱿鱼硫酸软骨素理化性质比较

李燕妮,郭 琳,许维娜

(滨州医学院葡萄酒学院,山东烟台 264003)

以美洲大赤鱿、巴氏柔鱼、阿根廷鱿鱼和太平洋褶皱柔鱼四种鱿鱼软骨为原料,经过酶解、超滤浓缩和乙醇沉淀的方法获得硫酸软骨素,其粘均分子量范围6.7×104(阿根廷鱿鱼)～1.57×105(美洲大赤鱿),硫酸软骨素E型(CS-E)二糖占总二糖比例的17%～46.9%。研究表明,四种鱿鱼都可以作为CS-E的生物来源。

鱿鱼,硫酸软骨素,酶解高效液相,硫酸软骨素E

目前全球鱿鱼产量一直处于增长的状态,从中提取的硫酸软骨素可以成为一种稳定的硫酸软骨素新来源。硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,CS)是糖胺多糖的一个亚族,是线性、复杂、聚合度分散的天然多糖,广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面。近些年来,越来越多的证据证实,硫酸软骨素在细胞分裂、细胞增殖、分化、迁移和创伤愈合中发挥重要的功能。根据CS硫酸化位点不同,通常将天然来源的CS硫酸化二糖分为A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等类型[1-3](见图1)。

硫酸软骨素E(CS-E)作为一种硫酸化二糖,或以硫酸软骨素E二糖为表征的多糖,拥有其他种类硫酸软骨素所不具备的独特药理活性[1],用于抗单疱疹病毒,与一般的激素药物相比,其引起过敏的可能性更低;CS-E作为抗癌药物,能有效抑制癌细胞向肺的转移[4-6];Scientific Reports 2015年报道表明,CS-E可以抑制雌激素缺乏诱发的骨质疏松[7]。这些都表明CS-E可以作为未来有效的新药研究对象。本文对美洲大赤鱿(Dosidicus gigas),巴氏柔鱼(Ommastrephes bartramii),阿根廷鱿鱼(Illex argentinus),太平洋褶皱柔鱼(Todarodes pacificus)四种鱿鱼(Ommastrephidaes)软骨来源的硫酸软骨素进行比较,阐明不同来源CS-E的理化性质和二糖结构区别,以便于对其进行进一步的药学应用研究。

图1 常见硫酸软骨素二糖单位Fig.1 Repeating unit of chondroitin sulfate

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四种鱿鱼软骨 烟台大宸食品有限公司;硫酸软骨素标准品及硫酸软骨素二糖标准品 sigma公司;硫酸软骨素ABC酶 sigma公司;氢氧化钠、盐酸、乙醇等其它试剂 上海化学试剂有限公司,均为分析纯;200万 u/g木瓜蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司。

Primo R 高速冷冻离心机 德国Heraeus公司;Minimate TFF system超滤机 PALL;8453 紫外-可见光分光光度计 惠普上海仪器有限公司;1260 Infinity 液相色谱 安捷伦;BILON-WSN4A 乌氏粘度计 上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粘均分子量的测定 采用文献[8]中测定高分子特征黏度的方法。

1.2.2 蛋白质含量测定 采用福林酚法。

1.2.3 比旋度测定 参照中国药典附录的方法[9]。

1.2.4 CS含量测定 采用美国药典氯化十六烷基吡啶(Hexadecylpyridinium chloride,CPC)法检测[10]。

1.2.5 硫酸软骨素二糖的测定 采用高效液相法:ZorbaxSAX色谱柱4.6 mm×250 mm,流速1.5 mL·min-1,柱温35 ℃,紫外232 nm检测。流动相A为0.2 mol·L-1NaCl,pH3.5,流动相B1.5 mol·L-1NaCl,pH3.5[11]。

表1 不同品种鱿鱼硫酸软骨素基本理化性质

1.2.6 硫酸软骨素的分离 取1 kg鲜新鱿鱼软骨,匀浆后加入5.0 L纯化水,使用氢氧化钠调节pH7.5～8.0,加入4.0 g(相当于软骨质量的0.4%)木瓜蛋白酶于50 ℃水解6 h。调节pH6.0,85 ℃处理10 min。将水解液5000 r/min离心20 min后去除不容物后再用微孔滤膜过滤澄清。

1.2.7 硫酸软骨素的纯化及得率 纯化的过程分为超滤浓缩和乙醇沉淀两个部分。超滤选用截留分子量10 ku的超滤膜进行水解液的浓缩,将料液浓缩到1/6体积。浓缩后的料液加入四倍体积无水乙醇,2000 r/min离心5 min得到硫酸软骨素沉淀,于60 ℃烘干4 h。CS得率的计算公式如下:

CS得率(%)=硫酸软骨素沉淀重量/鱿鱼软骨重量×100

2 结果与分析

2.1 硫酸软骨素基本理化性质

由表1可知,四种鱿鱼CS的粘均分子量差别很大,其中美洲大赤鱿体重最大,其CS粘均分子量1.57×105,也是最大的,阿根廷鱿鱼体型偏小,其CS粘均分子量为6.7×104,但以上4种鱿鱼软骨素粘均分子量都高于鲨鱼硫酸软骨素(4.5×104)和猪硫酸软骨素(2.1×104)[12];四种鱿鱼中蛋白质含量在2.9%～3.6%之间,都满足美国药典小于6.0%的质量要求[10],其中北太平洋鱿鱼的蛋白质含量最小,若对CS产品纯度要求较高时,北太平洋鱿鱼可作为首选。

比旋度是各国药典中鉴别不同生物来源CS的方法之一。四种鱿鱼CS比旋度都在-25°左右,差别不大。这与同为海洋动物的鲨鱼CS(-12°～-19°)不一致,而与陆生动物的比旋度相接近(-20°～-30°)[13]。

CS得率在2.7%～3.3%之间,其中阿根廷鱿鱼最高(3.3%),但都比一般陆生动物的低,比如新鲜的猪和牛鼻软骨硫酸软骨素含量就高达10%[3]。

2.2 硫酸软骨素二糖的构成

使用硫酸软骨素ABC酶将不同鱿鱼硫酸软骨素彻底水解成二糖,采用中国药典所用酶解高效液相的分析方法,可分析出其中的二糖含量,结果见表2。

由表2可知,四种鱿鱼的二糖单位CS-0含量在17.7%～21.7%之间,一般陆生动物如牛和猪来源的CS中CS-0含量仅为6.0%～9.0%,这也是鱿鱼CS与陆生动物CS二糖含量的差别之一。

表2 不同品种鱿鱼软骨硫酸软骨素二糖组成

注:鲨鱼软骨素中的双硫酸化二糖不是CS-E,而是CS-D。但是四种鱿鱼CS中CS-A单位与CS-C单位的比例却与陆生动物的类似(均大于1.0),尤其与牛CS(1.4～1.8)最为相近,与鲨鱼的不同(小于1.0)[14]。

鱿鱼CS拥有特殊的二糖单元,即CS-E,其一个二糖单元含有两个硫酸基。四种鱿鱼CS中CS-E含量范围为17%～46.9%,品种之间含量差别较大,以阿根廷鱿鱼CS的含量最高。鱿鱼CS在与蛋白质或其他细胞组分发生相互反应时,硫酸基起到了非常重要的作用[1],因此阿根廷鱿鱼提取的CS可能具有更高的生物活性。

现以美洲大赤鱿硫酸软骨素为例,其酶解高效液相图谱见图2。

图2 美洲大赤鱿硫酸软骨素酶解高效液相图Fig.2 Dosidicus gigas cartilage chondroitin sulfate enzymolysis-HPLC

3 结论

本文比较了四种鱿鱼软骨硫酸软骨素的粘均分子量、蛋白质含量、CS含量和二糖单元组成等影响硫酸软骨素作为药物的理化性质。其中不同品种鱿鱼其粘均分子量范围为6.7×104～1.57×105,鱿鱼特有的CS-E二糖单元含量差别较大,其中阿根廷鱿鱼CS-E二糖含量最高。本文为选择鱿鱼软骨作为硫酸软骨素原料提供了数据参考。

[1]Shuhei Yamada,Kazuyuki Sugahara. Potential Therapeutic application of chondroitin sulfate/dermatan sulfate[J].Current Drug Discovery Technologies,2008,5(4):289-301.

[2]Nicola Volpi. Analytical aspects of pharmaceutical grade

chondroitin sulfates[J].Pharmaceutical Sciences,2007,96(12):3168-3180.

[3]Chiara Schiraldi,Donatella Cimini,Mario De Rosa. Production of chondroitin sulfate and chondroitin[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2010,87:1209-1220.

[4]Bergefall K,Trybala E,Johansson M,et al.Chondroitin sulfate characterized by the E-disaccharide unit is a potent inhibitor of herpes simplex virus infectivity and provides the virus binding sites on gro2C cells[J].Virology,1995,208(2):531-539.

[5]Sato Y,Nakanishi K,Tokita Y,et al. A highly sulfated chondroitin sulfate preparation,CS-E,prevents excitatory amino acid-induced neuronal cell death[J].J Neurochem,2008,104(6):1565-1576.

[6]Li F,Ten Dam GB,Murugan S,et al. Involvement of highly sulfated chondroitin sulfate in the metastasis of the lewis lung carcinoma cells[J].J Biol Chem,2008,283(49):34294-34304.

[7]Toshiyasu Koike,Tadahisa Mikami,Miharu Shida,et al. Chondroitin sulfate-E mediates estrogen-induced osteoanabolism[J].Scientific Reports,2015,5:8994,1-6

[8]史敏娟.低相对分子质量硫酸软骨素的制备和性质研究[D].四川:西南科技大学,2013.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典第二部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:1340-1341.

[10]United States Pharmacopeia(USP 39-NF34)[M]. The United States:The United States Pharmacopeia Convention,2016:6570-6572.

[11]王皓,于广利,赵峡.大鼠肾脏糖胺聚糖的种类及其二糖组成分析[J].光谱学与光谱分析,2010,30(9):2484-2487.

[12]孙凌云,范慧红.高效凝胶渗透色谱法测定硫酸软骨素的分子量及其分布[J].中国生化药物杂志,2001,22(4):180-181.

[13]范慧红.硫酸软骨素质量控制研究进展[C].2015第七届硫酸软骨素会议专刊,15-28.

[14]Neha S Gandhi,Ricardo L Mancera. The structure of glycosaminoglycans and their interactions with proteins[J]. Chemical Biology Drug Design,2008,72(6):455-482.

The properties of chondroitin sulfate from variousOmmastrephidaes

LI Yan-ni,GUO Lin,XU Wei-na

(School of Enology,Binzhou Medical College,Yantai 264003,China)

Chondroitin sulfate(CS)was purified from the cartilage of Dosidicus gigas,Ommastrephes bartramii,Illex argentinus,Todarodes pacificus,and characterized in an effort to find alternative sources and new peculiar structures of this complex biomacromolecule utilized in the pharmaceutical and nutraceutical industry. Molecular mass values of CS was ranging from 6.7×104for Illex argentinus up to 1.57×105for Dosidicus gigas. The disulfated disaccharides was in a range of 17.0%～46.9%. The presence of theseOmmastrephidaesmay be a useful marke for the origin of CS.

Ommastrephidaes;Chondroitin Sulfate;Enzymolysis-HPLC;CS-E

2016-06-28

李燕妮(1980-)，女，硕士，讲师，研究方向：海洋产物分离提取，E-mail：lyn0158@126.com。

山东省高等学校科技计划(J16LC57)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000