日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

张兰，滕珂，肖国增，梁小红，许立新 ，尹淑霞，晁跃辉*

(1.北京林业大学林学院草坪研究所，北京 100083； 2.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)



日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

张兰1**，滕珂1**，肖国增2，梁小红1，许立新1，尹淑霞1，晁跃辉1*

(1.北京林业大学林学院草坪研究所，北京 100083； 2.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

为研究日本结缕草ZjADH基因是否与植物耐寒有关，通过DNA重组技术将ZjADH基因插入3302Y质粒中，成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH，通过农杆菌介导的花序侵染法获得具有草铵膦抗性的转基因植株。PCR和qRT-PCR鉴定表明，目的基因已整合入拟南芥基因组中并能够成功表达。对野生型和转基因拟南芥进行低温(4 ℃)处理和耐寒分析，结果表明，转基因拟南芥对低温胁迫的抵抗能力明显高于未转基因植株。在低温胁迫下，转基因拟南芥中脯氨酸的含量显著高于野生型植株，而活性氧的积累明显低于野生型植株；对转基因植物抗性相关基因的表达分析显示：转基因植物体内SOD、APX及LEA基因的表达水平明显高于未转基因植株，说明ZjADH基因可能通过提高转基因植物体内SOD、APX及LEA的表达活性来增强植物的抗寒性。综上所述，日本结缕草ZjADH基因的表达能够提高转基因植株的耐寒性，对ZjADH基因的研究也为进一步获得抗寒转基因日本结缕草植株奠定理论依据。

ZjADH基因；转基因拟南芥；低温胁迫；脯氨酸；活性氧

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)虽然是植物中一个小的基因家族，但在植物抵抗低温、干旱和高盐等环境胁迫时，ADH通过将乙醛转化为乙醇，产生少量能量来维持植物在逆境条件下的能量需求[1]。有关ADH基因在植物抵抗冷害胁迫中已有报道，研究表明，在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)和谷类作物中，ADH基因在其抵抗低温胁迫的过程中发挥重要的作用，是低温诱导基因之一[2]；在玉米(Zeamays)幼苗遭受冷害胁迫时，植物体内ADH基因的表达量增加，而且在其双缺失突变体Adh1-Adh2中，细胞膜损伤严重，直接导致细胞受损[3]；水稻(Oryzasativa)幼苗在低温胁迫下，通过快速诱导该基因的表达，提高ADH的活性从而加强乙醇发酵途径[4]。在野草莓(Fragariavesca)抵御低温的过程中，ADH基因成为标记候选基因[5]；小果野蕉(Musaacuminata)ADH基因(MaADH)的表达也随温度的降低而逐渐升高[6]。

日本结缕草(Zoysiajaponica)主要分布在亚热带和热带地区，在改良生态环境、园林绿化和固土护坡等方面都起着不可代替的作用[7]，但因其不能在夏季太短或冬季太冷的地方生存，且在气温降至10 ℃以下时，生长缓慢或停止，叶片开始变黄甚至萎蔫，大大降低了其坪用价值和观赏价值[8]。因此，低温是限制和影响日本结缕草坪用性状、自然分布和推广应用的主要因素[9-10]。随着全球气候变暖影响，种植在过渡地带的日本结缕草更容易受“倒春寒”气候的影响。本实验室前期已从日本结缕草中克隆到ADH基因，被命名为ZjADH(GenBank登录号为：KT596065)。在前期实验的基础上，通过构建植物表达载体3302Y-ZjADH，利用根癌农杆菌介导法转化野生型拟南芥，经除草剂草铵膦筛选和PCR鉴定转基因植株后，对野生型和转基因拟南芥进行冷胁迫处理及其相关生理生化指标测定，以此分析ZjADH基因在可能提高植物耐寒性上所发挥的作用，为该基因在抗寒作物的育种上提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验所用日本结缕草品种Zenith 的种子购自美国Hancock种子公司；野生型拟南芥(A.thaliana, Col-0)为本实验室保存，播种参照Clarke的方法[11]，试验于2015年6-12月，在北京林业大学苗圃温室和草坪实验室进行。MS培养基、表面活性剂Silwet-77购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ以及反转录试剂盒购自Takara公司；实时荧光定量SYBR Mixture购自康为世纪生物科技有限公司；无缝连接酶购自中美泰和生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1ZjADH基因植物表达载体的构建 根据本实验室前期得到的日本结缕草ADH基因的已知序列设计用于构建植物表达载体的引物，ADH-F：CACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGGCGACCGCCGGG-AAGGT；ADH-R：GGTACACGCGTACTAGTCAGATCGTTCTCCATGCGGATGATGCAG。以pEASY-ADH质粒为模板，ADH-F和ADH-R为引物，扩增出带有酶切位点的ADH基因的ORF。

通过BglⅡ限制性内切酶对3302Y质粒进行酶切处理，利用核酸纯化试剂盒分别回收目的DNA。将纯化的PCR产物及3302Y按照1∶1比例混匀，在无缝连接酶的作用下50 ℃反应15 min。将反应产物转化至大肠杆菌感受态细胞Trans-T1，并将其涂布含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上，经抗生素筛选后挑取能在平板上生长的单菌落，使用引物3302Y-F(TGACGCACAATCCCACTATCCTT)和3302Y-R(CCGTCCAGCTCGACCAGGAT)进行菌体PCR检测。琼脂糖凝胶电泳检测过后，将能够扩增出目的大小的DNA的大肠杆菌菌液送至北京睿博生物技术公司进行测序检测。

1.2.2 拟南芥的转化和筛选 利用CaCl2冻融法将1.2.1得到的正确重组质粒导入根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，挑取阳性农杆菌转化子，以3302Y-F和3302Y-R为引物进行菌体PCR鉴定。将含有植物表达载体3302Y的农杆菌重新悬浮于侵染液中(含5%蔗糖和 0.05% Silwet-L77的1/2 MS培养液)；采用优化的花序侵染法[11-12]将处于花蕾期的野生型拟南芥的花序浸泡在侵染液中，保持1～2 min，侵染后以较高的湿度在培养箱中暗培养24 h后正常培养。1周后再侵染一次，直至拟南芥正常开花结果，收获种子。

将收获的拟南芥种子消毒后，均匀撒在土中，放置在光照培养箱中，待拟南芥幼苗展开两片子叶，对其喷施60 mg/L草铵膦，观察生长状态。挑取能够正常生长的抗性幼苗，转移至新花盆中，继续生长。

1.2.3 再生植株的检测 由于野生型拟南芥基因组中存在ADH基因序列，所以使用植物表达载体3302Y通用引物进行PCR鉴定。采用CTAB 法提取野生型和转基因型拟南芥的基因组DNA，以3302Y-F和3302Y-R为上下游引物，基因组DNA为模板进行PCR鉴定。用Trizol 法提取拟南芥总RNA[13]，使用Primerscrip反转录试剂盒合成第一链cDNA，以ADH-RT-F(TGTAAACCCGAAAGACCACAAGAA)和ADH-RT-R(GTACGCCCACCAGAACAGCAAC)为引物，cDNA为模板，拟南芥看家基因UBQ10(GenBank登陆号为：CP002687；UBQ10-F：AGTCCACCCTTCATCTTGTTCTC，UBQ10-R：GTCAGCCAAAGTTCTTCCATCT)作为内参基因，qRT-PCR检测拟南芥中ZjADH基因的相对表达量。反应程序为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s；68 ℃ 1 min，40个循环。所得结果采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 转基因植株的低温处理 将正常条件下生长30 d的转基因和野生型拟南芥植株，转移至低温光照培养箱中，处理温度为4 ℃。待14 d后，观察表型，分析转基因和野生型拟南芥对低温的抵抗能力。此外，将低温胁迫处理的植物取部分样本后，立即放于液氮中速冻，之后保存于-80 ℃超低温冰箱中，以备后续实验。

1.2.5 转基因拟南芥抗逆相关基因的表达分析 为分析日本结缕草ZjADH基因对转基因拟南芥中其他抗逆相关基因的影响，通过qRT-PCR，对转基因和野生型拟南芥中的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)基因(APX-F：CTCTGGGACGATGCCACAAG；APX-R：CTCGACCAAAGGACGGAAAA)、过氧化物酶(peroxidase，POD)基因(POD-F：CCAAACTCTTCGTGGACTATGC；POD-R：AACTCTTGGTCGCTCTGGAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)基因(SOD-F：CGCATGATCCTTTGGCTTCG；SOD-R：TCCTGGTTGGCTGTGGTTTC)以及晚期胚胎发生丰富蛋白(late embriogenesis abundant protein，LEA)基因(LEA-F：GATTGACCCGGCTGAGCTACGA；LEA-R：AGATGGGATTCACCACAAAAGA)进行实时荧光定量检测，以拟南芥看家基因UBQ10作为内参基因。基因相对表达量的算法具体参照1.2.2。

1.2.6 拟南芥生理指标的测定 分别对低温处理后的野生型和转基因植株进行脯氨酸含量[14]和活性氧积累[15]的测定，明确其抗逆情况。

1.3 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0对荧光定量所得数据进行统计分析，Sigma Plot软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 转ZjADH基因拟南芥的鉴定

图1 转ZjADH基因拟南芥鉴定Fig.1 Validation of transgenic A. thaliana

通过花序侵染法，转化野生型拟南芥植株，收种筛选。喷施草铵膦7 d后，未转化成功的拟南芥逐渐枯萎、死亡，而转基因成功的拟南芥仍能保持绿色，正常生长。提取具有草铵膦抗性的拟南芥基因组DNA，进行PCR检测。PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测分析表明，所选的拟南芥大多均能在1100 bp左右的位置处扩增出一条与目的基因大小吻合的条带(图1)，初步证明，目的基因ZjADH转化拟南芥成功。

图2 野生型与转基因拟南芥中ZjADH基因的相对表达水平 Fig.2 Relative expression levels of ZjADH in wild type and transgenic A. thalianaWT：野生型拟南芥Wild type A. thaliana；OE-1，OE-2：转基因拟南芥Transgenic A. thaliana. 下同 The same below.

图3 野生型和转基因拟南芥低温处理Fig.3 Cold treatment of WT and transgenic A. thaliana

图4 野生型与转基因拟南芥中脯氨酸含量Fig.4 Proline contents in WT and transgenic A. thaliana0 d：正常生长条件Normal conditions；14 d：低温处理14 d Cold conditions for 14 days.

图5 野生型与转基因拟南芥中活性氧的积累 Fig.5 Accumulation of ROS in WT and transgenic A. thaliana

利用荧光定量RT-PCR的方法分析转基因及野生型拟南芥中ZjADH基因的表达情况，结果表明，在转基因植株中ZjADH基因高效表达，而野生型拟南芥中没有检测到日本结缕草ZjADH基因的表达(图2)。选取高效表达外源基因的拟南芥植株OE-1和OE-2进行下一步的实验。

2.2 低温胁迫下转基因拟南芥的生理生化指标分析

2.2.1 低温胁迫提高转基因拟南芥的抗寒性 本实验室前期对ZjADH基因的研究表明：ZjADH基因受低温胁迫诱导表达。为进一步研究ZjADH基因是否与提高植物抗寒性有关，从生理生化角度分析转ZjADH基因的拟南芥与野生型之间的异同。4 ℃低温处理使得转基因和野生型拟南芥均呈现不同程度的萎蔫，但转基因拟南芥明显比野生型拟南芥生长状态要好，尤其是OE-2植株，叶片几乎没有变化(图3)。从叶片表型的异同说明转ZjADH基因的拟南芥与野生型相比，抗寒性有所差异。

2.2.2 转ZjADH基因提高脯氨酸含量 植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性[16]。因此，测定低温处理前后野生型和转基因拟南芥中脯氨酸的含量，结果显示：无论是野生型还是转基因植株低温处理后脯氨酸含量均有明显的升高，但转基因植物中脯氨酸提高的水平明显高于野生型，其中OE-1低温处理后脯氨酸含量升高355%，OE-2升高了408%，而野生型升高了127%(图4)。结果表明，转ZjADH基因的拟南芥植株能显著增加低温处理后脯氨酸的含量。

2.2.3 转ZjADH基因对活性氧自由基的影响 环境胁迫会使植物细胞积累大量的活性氧，从而损伤生物大分子，甚至毒害植物细胞[17]。用DAB染液分别侵染低温处理后野生型和转基因拟南芥叶片，结果显示：野生型拟南芥叶片过氧化氢的积累量显著高于OE-1和OE-2，尤其是OE-2植物叶片中超氧负离子和过氧化氢的积累量明显少于野生型拟南芥(图5)。结果表明，转ZjADH基因的拟南芥植株能通过消除体内活性氧的过量积累而提高抗逆性。

图6 抗氧化基因相对表达水平Fig.6 Relative expression levels of genes involved in anti-oxidation

2.2.5 转ZjADH基因对LEA基因的影响研究

图7 LEA相对表达水平Fig.7 Relative expression levels of LEA

表明，拟南芥、烟草(Nicotianatabacum)、桑树(Morusalba)，菠菜(Spinaciaoleracea)等植物在受到冷害胁迫后，可诱导大量LEA蛋白表达，从而减缓低温对植物引起的伤害[19]。为了分析ZjADH基因对植物体内LEA基因表达的影响，进行了实时荧光定量检测。结果显示：转基因植物中LEA基因的表达水平显著高于野生型，其中OE-1中LEA基因表达水平提高了127%，OE-2中LEA基因表达水平提高了151%(图7)。由此表明，ZjADH基因能够通过提高LEA基因的表达水平，进而增强转基因植物对低温的抵抗能力。

3 讨论

转基因作为基因工程的一种重要技术，在基因功能鉴定方面得到了越来越多的应用。在模式植物中表达外源基因，可通过表型观察和相关生理指标测定初步分析其功能。本研究中的ZjADH基因是本实验室在前期研究获得的，其核酸长度1140 bp，编码一条379个氨基酸的多肽链，C端有一个ADH-Zinc-N结构，属于MDR超家族。前人报道表明，ADH基因不仅参与植物器官的生长发育，而且在逆境胁迫条件下，植物会通过ADH参与的乙醇代谢途径而获得能量，同时也减少了乙醛对植物体的伤害[20]。目前，虽然已经从不同物种中克隆出ADH基因，并分析了其在不同激素和环境胁迫下的表达模式，但通过拟南芥转化研究日本结缕草ADH基因功能的文章尚未报道。研究表明，不同物种中，ADH基因的耐受性有所差异：烟草中ADH基因的表达更易受干旱和盐胁迫诱导；大豆(Glycinemax)中ADH基因的表达虽不受冷害和干旱胁迫影响，但涝害能明显诱导其表达；在谷类作物和香蕉中，ADH基因是响应冷胁迫较常见的一种基因[21]。日本结缕草ADH基因在前期的研究结果表明，低温、干旱和高盐胁迫均能诱导ZjADH基因的表达，鉴于日本结缕草在过渡地带易受低温环境影响，因此，通过转基因的方法能更进一步明确ZjADH基因在提高植物耐寒性上的作用。

在低温等逆境条件下，为维持正常的新陈代谢活动，植物体内会通过基因表达和酶活性的变化富集一系列具有保护功能的亲水性蛋白，如胚胎发育晚期丰富蛋白LEA等来保护其免受伤害[22]。前人研究表明，LEA蛋白具有清除活性氧自由基等功能[23]。此外，对转柽柳(Tamarixchinensis)LEA基因烟草的耐低温分析表明，野生型烟草的相对电导率和丙二醛含量明显高于转基因烟草，表明柽柳LEA蛋白基因的导入提高了烟草的耐低温能力[24]。本研究中转ZjADH基因拟南芥中LEA基因的相对表达水平显著高于野生型，该结果表明，ZjADH基因一方面可能通过提高植物体内LEA基因的表达水平清除体内过量活性氧的积累，防止植物受氧化损伤；另一方面可能通过富集大量的LEA蛋白提高植物的耐寒性。

正常情况下，植物体内活性氧的产生和清除总是处于动态平衡，但在遭受非生物胁迫时，会迫使植物体内细胞产生大量活性氧自由基，而其对细胞有明显的毒害作用[17]。本研究结果表明ZjADH基因不仅能增强植物体内SOD和APX基因的表达水平，而且转基因拟南芥在低温胁迫下过氧化氢和超氧阴离子自由基的积累明显少于野生型，说明ZjADH基因很可能通过提高植物体内SOD和APX基因的表达水平而清除植物体内过量活性氧的积累，从而减少植物在低温条件下产生的氧化损害。至于转基因植株中POD表达量下降的原因，还需做进一步的实验研究。

脯氨酸作为一种重要的植物逆境响应的指标，实验证明脯氨酸在植物遭受冷害胁迫时，通过渗透调节作用保护原生质体和蛋白质分子，也可以作为能源物质和N源来补偿植物所需能源的不足[16]。因此，低温条件下植物体内脯氨酸的积累被广泛用于抗寒力鉴定。本实验中，转基因植物与野生型在正常条件下，脯氨酸含量没有明显差别，但低温处理14 d后，转基因植物脯氨酸提高的水平明显高于野生型的提高水平，说明ZjADH可能通过调节脯氨酸含量来提高植物的耐低温性。

4 结论

本研究成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH，通过转化野生型拟南芥，获得转ZjADH基因植株，低温胁迫下，转基因拟南芥能通过增强体内SOD、APX和LEA基因的表达水平、增加脯氨酸含量及清除活性氧自由基的过量积累来提高植物的耐寒性，为利用基因工程技术培育抗寒性的日本结缕草新品种提供了理论依据。

在新时期、新课程的背景下，自主阅读教学研究成为高中语文教学的重要课题，语文阅读教学目标是否正确、教育成败优劣深深地影响着我国国民素质的高低，影响未来人才质量的高低。所以教师要在实际教学中，促使学生进行自主学习，通过对话教学不断提高学生对语言的运用能力，充分发挥学生自主学习的效果，使学习达到最佳效果。

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Transformation ofZjADHgene intoArabidopsisthalianaand cold-tolerance analysis of transgenic plants

ZHANG Lan1**, TENG Ke1**, XIAO Guo-Zeng2, LIANG Xiao-Hong1, XU Li-Xin1, YIN Shu-Xia1, CHAO Yue-Hui1*

1.TurfgrassResearchInstitute,CollegeofForestry,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.TheCollegeofHorticultureandGarden,YangtzeUniversity,Jingzhou434025,China

To study the relationship between theZjADHgene and plant cold tolerance, a plant expression vector 3302Y-ZjADH was constructed through DNA recombination technology. TransgenicArabidopsisthalianaplants with glufosiante resistance were generated by floral dip method. PCR and qRT-PCR results showed that the target gene was successfully integrated with the genomes of Arabidopsis and could express efficiently. Both wild type and transgenic Arabidopsis plants were subjected to 4 ℃ to investigate their cold tolerance. Tests demonstrated that, compared with the wild type, the transgenic plants were more tolerant of cold stress. The free proline content in transgenic plants was significantly higher than the control, while the accumulation of ROS was much lower than the wild type. In addition, the expression levels of genes related to stresses likeSOD,APXandLEAin transgenic plants were much higher than in the control. Results indicated that over-expression ofZjADHmay improve the activities of superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) and late embryogenesis abundant proteins (LEA) to improve the cold tolerance of transgenic plants. In conclusion, the heterologous expression ofZjADHgenes could reinforce the resistance of plants to cold stress. This study provides a theoretical foundation for future research on theZjADHgene and the cultivation of cold-tolerantZoysiajaponicacultivars.

ZjADHgene； transgenicArabidopsisthaliana； cold stress； proline； ROS

10.11686/cyxb2016158

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-04-12；改回日期：2016-06-06

北京林业大学科技创新计划项目(BLX2014-06)，国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102607)和中国林学会-青年人才托举工程资助。

张兰(1990-)，女，甘肃平凉人，在读硕士。E-mail: zhangdalan@bjfu.edu.cn。滕珂(1989-)，男，山东淄博人，在读博士。 E-mail: tengke@bjfu.edu.cn。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.*通信作者Corresponding author. E-mail: chaoyuehui@163.com

张兰，滕珂，肖国增，梁小红，许立新，尹淑霞，晁跃辉. 日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析. 草业学报, 2016, 25(11): 43-49.

ZHANG Lan, TENG Ke, XIAO Guo-Zeng, LIANG Xiao-Hong, XU Li-Xin, YIN Shu-Xia, CHAO Yue-Hui. Transformation ofZjADHgene intoArabidopsisthalianaand cold-tolerance analysis of transgenic plants. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 43-49.