刈割期及添加剂对苜蓿青贮品质及CNCPS蛋白组分的影响

李真真，白春生，余奕东，玉柱*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳110866；3.鄂尔多斯市农牧业科学研究院，内蒙古 鄂尔多斯017000)



刈割期及添加剂对苜蓿青贮品质及CNCPS蛋白组分的影响

李真真1，白春生2，余奕东3，玉柱1*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳110866；3.鄂尔多斯市农牧业科学研究院，内蒙古 鄂尔多斯017000)

本试验旨在研究生物及化学添加剂对不同时期刈割的苜蓿青贮品质的影响。试验采用现蕾期和初花期刈割的中苜一号苜蓿(70%水分含量)为原料，分别设置添加：1)空白组；2)乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+50 mg/kg)；3)乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg)；4)甲酸+丙酸(6 mL/kg)4个处理组，使用0.5 L塑料桶调制罐装青贮，并于发酵30 d后开罐取样分析。结果表明，与现蕾期相比，初花期苜蓿青贮饲料的乳酸(LA)产量较高，丁酸(BA)和氨态氮(NH3-N)生成量较低(P<0.01)，pH值也较低(P<0.05)，同时非蛋白氮(PA)和结合蛋白质(PC)含量也显著低于现蕾期(P<0.01)。3个添加剂处理组均显著地提高了青贮发酵的品质，降低pH值(P<0.01)和氨态氮生成量(P<0.01)。其中，乳酸菌+纤维素酶显著地提高了乳酸含量及乳酸/乙酸(LA/AA)(P<0.01)，甲酸+丙酸则显著抑制了丁酸的产生(P<0.01)。同时，3组添加剂均显著地提高了青贮饲料中可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白(CP)的含量，并降低了中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量(P<0.01)。就蛋白组分而言，乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg)和甲酸+丙酸处理组显著地降低了青贮饲料中非蛋白氮和结合蛋白质的含量(P<0.01)，提高了真蛋白(PB)的含量(P<0.01)。综合而言，甲酸+丙酸处理组苜蓿青贮料的品质最佳，乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg)次之。

刈割期；添加剂；苜蓿；青贮品质；CNCPS

紫花苜蓿(Medicagosativa)是国内外主要栽培的优质牧草之一，因其富含蛋白质，营养价值高而广受关注[1]。刈割收获是紫花苜蓿生产的关键环节，由于受光照、气温及水分等的影响，在一个生育期处于不同生育阶段的苜蓿其水分、粗蛋白、可溶性碳水化合物等指标均存在差异，因此，合理的刈割时期对于青贮加工的品质及产量均有重要的影响[2]。同时，苜蓿由于本身附着乳酸菌、可溶性碳水化合物含量低且缓冲能高等原因难以获得优质的青贮饲料[3]，生产中通常使用乳酸发酵促进剂(乳酸菌制剂、酶制剂等)、不良微生物抑菌剂(甲酸、丙酸等)等添加剂提高其发酵品质[4]。

在青贮过程中，原料中的真蛋白在植物酶的作用下转化为非蛋白氮，造成蛋白质水解，降低青贮饲料的营养价值[5]。尤其对于苜蓿等蛋白质含量丰富的豆科植物，研究其青贮后的蛋白质组成更加重要。康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(cornell net carbohydrate and protein system, CNCPS)是由美国康奈尔大学科学家提出的基于瘤胃降解特征的饲料评价体系，该体系将饲料蛋白质划分为3个部分：PA(非蛋白氮)、PB(真蛋白)和PC(结合蛋白)，其中，真蛋白又根据其在瘤胃中的降解速度分为PB1、PB2、PB3三部分[6]。根据蛋白质降解的快慢，较为准确地反映其在瘤胃中的发酵情况，评价饲料的可利用程度，从而更好地用于调配日粮。CNCPS作为一个新的体系，经过不断地完善和补充，在实际生产中发挥很大的指导作用。

目前，实际生产中常使用生物添加剂和化学添加剂以保证苜蓿青贮饲料的发酵品质，但关于不同添加剂和刈割时期对于苜蓿青贮饲料中蛋白质组分的研究较为缺乏。因此，本试验选用生产上常用的生物及化学添加剂，研究其对于现蕾期和初花期刈割的紫花苜蓿青贮饲料发酵品质及CNCPS蛋白质组分的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料：本试验开展时间为2014年6月至9月，试验以中国农业大学涿州农业科技园种植的第一茬苜蓿(中苜一号)为原料，分别在现蕾期和初花期刈割后进行晾晒至含水量降至70%左右，使用切碎机切碎为2 cm左右。

青贮添加剂：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP)，由中国农业大学牧草青贮研究室提供，添加量为105cfu/g鲜草。

纤维素酶(C)：固态酶，多组分的复合生物催化剂，由山东信得利生物工程有限公司提供，标准酶活力单位(CMC酶)1060 U/g，添加量分别为50和100 mg/kg鲜草。

有机酸(FA+PRA)：将甲酸(formic acid,FA)和丙酸(propionic acid,PRA)分别稀释为45%后按照1∶1勾兑，添加量为6 mL/kg鲜草。

1.2 试验设计及青贮方法

每个刈割时期均设置4个处理组，分别为：1)空白组(Control)；2)乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+50 mg/kg，LP+C50)；3)乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg，LP+C100)；4)甲酸+丙酸(6 mL/kg，FA+PRA)。

将切碎的苜蓿原料与添加剂分别混合均匀后,装入0.5 L聚乙烯桶中，压实后盖上内外盖并封口，每个处理组设有3个重复，在室温下贮藏30 d后开封，取样分析。

1.3 分析方法

青贮饲料开封后，准确称取样品20 g，加入180 mL蒸馏水混合均匀，再用榨汁机搅拌1 min，用4层纱布和定性滤纸过滤，制备青贮浸出液，测定pH值。浸出液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，测定乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸和丁酸(butyric acid, BA)含量。剩余样品称取200 g左右以及原料分别于65 ℃条件下烘干48 h，测定干物质含量(DM)。烘干的样品用微型植物粉碎机粉碎，过1 mm筛，用于测定粗蛋白(crude protein, CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)等营养成分。

采用雷磁pHS-3C型pH计测定pH值[7]。采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪测定有机酸(色谱柱：KC-811 column，Shimadzu，日本；检测器：SPD-M10AVP；流动相：3 mmol/L高氯酸，流速1 mL/min，柱温50 ℃；检测波长210 nm，进样量5 μL[8])。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮含量[9]。用凯氏定氮法测定青贮饲料及原料的粗蛋白含量[10]。采用Van Soest[10]的方法测青贮饲料及原料的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量。采用硫酸-蒽酮比色法测定可溶性碳水化合物[11]。依据Licitra等[12]的方法测定可溶性蛋白(soluble protein, SOLP)和非蛋白氮(non-protein nitrogen, NPN)。中性洗涤不溶氮(NDF insoluble protein, NDFIP)和酸性洗涤不溶氮(ADF insoluble protein, ADFIP)按照Van Soest等[13]的方法进行测定。

1.4 CNCPS蛋白组分的计算方法

根据Sniffen等[6]的方法进行。

PA(% CP)=NPN(% CP)

PB1(% CP)=SOLP(% CP)-PA(% CP)

PB3(% CP)=NDFIP(% CP)-ADFIP(% CP)

PC(% CP)=ADFIP(% CP)

PB2(% CP)=100-PA(% CP)-PB1(% CP)-PB3(% CP)-PC(% CP)

式中：PA (% CP) 为非蛋白氮占粗蛋白的百分比；PB1(% CP) 为快速降解蛋白占粗蛋白的百分比；PB2(% CP) 为中速降解蛋白质占粗蛋白的百分比；PB3(% CP) 为慢速降解蛋白质占粗蛋白的百分比；PC (% CP) 为结合蛋白质占粗蛋白质的百分比。式中百分号仅为单位，不参与乘法计算，故数值相乘后需乘以100%，使得出的单位为百分数。

1.5 数据处理与分析

采用SAS软件对实验结果进行方差分析和双因素分析。

2 结果与分析

2.1 不同刈割期苜蓿原料的化学成分

由表1可知，与现蕾期相比，初花期苜蓿含有较高的WSC、NDF及ADF含量，同时其CP含量低于现蕾期原料。

表1 两个刈割期苜蓿原料的化学成分

DM: Dry matter; WSC: Water soluble carbohydrate; CP: Crude protein; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber；下同 The same below.

表2 刈割期、添加剂对苜蓿青贮品质的影响(干物质基础)

LP+C50：添加乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+50 mg/kg)；LP+C100：添加乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg)；FA+PRA：添加甲酸+丙酸(6 mL/kg)。同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

LP+C50: 105cfu/gL.plantarumand 50 mg/kg cellulase; LP+C100: 105cfu/gL.plantarumand 100 mg/kg cellulase; FA+PRA: 6 mL/kg formic acid+propionic acid; LA: Lactic acid; AA: Acetic acid; PRA: Propanoic acid; BA: Butyric acid; TN: Total nitrogen; ND: Not detected; Different small letters in the same column mean significant differences (P<0.05), the same letters mean no significant difference (P>0.05), the same below.

2.2 添加剂对于两个刈割期苜蓿青贮发酵品质及营养价值的影响

初花期苜蓿青贮的pH值低于现蕾期苜蓿(P<0.05)(表2)，但LA和AA生成量较高，而NH3-N生成量也显著小于现蕾期苜蓿(P<0.05)。就养分含量而言，初花期的WSC显著高于现蕾期(P<0.05)，而CP较之略低。

使用LP+C和FA+PRA均可以显著降低青贮的pH值、BA及NH3-N含量(P<0.05)，提高LA生成量及LA/AA(P<0.05)，增加WSC和CP的含量(P<0.05)，并显著降低NDF和ADF含量(P<0.05)。生物添加剂处理组中，NDF和ADF含量随纤维素酶使用量的增加而降低。而FA+PRA处理组的pH值和NH3-N低于生物添加剂处理组，且未检测到BA产生(表2)。

2.3 添加剂对于两个刈割期苜蓿青贮饲料CNCPS蛋白组分的影响

水力压裂模型中，压裂孔位于中心位置，周围均匀布置4个控制孔，依次编号为A1、A2、A3、A4。笔者通过在控制孔A2和A3内施加恒定的控制水压，A1、A4孔内无水压，以此促使煤体孔隙压力场表现出非对称分布的特征，如图2所示，以此研究孔隙压力场分布特征对煤体起裂以及裂隙扩展规律的影响。

初花期苜蓿青贮料的PA显著低于现蕾期，但PB1、PB2、PB3组分均较高(表3)。LP+C100和FA+PRA处理组可显著降低青贮饲料中的PA、PC组分，增加PB组分含量(P<0.05)，且此效果在FA+PRA组最显著。

3 讨论

在本试验中，初花期刈割的苜蓿原料在30 d的发酵之后pH值低于现蕾期苜蓿，添加剂处理组的pH值均低于4.2，乳酸的生成量较高，且丁酸和氨态氮产量也显著低于现蕾期。这是由于初花期苜蓿原料中的WSC含量高于现蕾期，可发酵底物含量较多。这与李光耀等[2]的研究结果一致，随着苜蓿生育期的延长，苜蓿中的可溶性碳水化合物含量呈先升高后降低的变化趋势，且在初花期达到最大值。苜蓿青贮过早，不仅可发酵底物较少，而且含水量太高，会因大量的丁酸发酵而失败。

表3 刈割期、添加剂对苜蓿青贮CNCPS蛋白组分的影响(粗蛋白基础)

PA: Non-protein nitrogen; PB1: Fast degradable protein; PB2: Moderate degradable protein; PB3: Slow degradable protein; PC: Unusable protein.

使用乳酸菌+纤维素酶和甲酸+丙酸都可以显著地提高苜蓿青贮发酵品质，其中乳酸菌+纤维素酶的作用原理为促进乳酸发酵，而甲酸+丙酸是抑制有害发酵，从而降低pH值以抑制梭菌等有害菌的活动及蛋白质水解酶作用[14-15]。梭菌等有害菌以可溶性碳水化合物、有机酸和蛋白质为底物，发酵产生丁酸和氨态氮，不仅造成营养成分的损失，还会影响青贮饲料的口感，造成动物中毒[4]。因此丁酸的含量和氨态氮是衡量青贮饲料优劣的重要指标[16]。一般认为优质的青贮饲料的丁酸含量应低于1%，氨态氮/总氮应低于10%[17]。在本试验中，3个添加剂处理组对于苜蓿青贮发酵品质都有极显著的改善作用，均增加了乳酸、乳酸/乙酸，降低丁酸和氨态氮产量，并显著地抑制了可溶性碳水化合物和粗蛋白的降解。其中FA+PRA对于两个刈割时期苜蓿原料均有很好的作用效果，表现为低pH值(4.29和4.01)、无丁酸、少量氨态氮(6.22%和2.51%总氮)。LP+C在初花期苜蓿原料中获得理想的青贮发酵结果，而在现蕾期苜蓿原料青贮的pH值略高，且有丁酸和氨态氮产生。另外，两类添加剂的使用显著地增加贮料中WSC含量并降低了NDF及ADF的含量，可能利于提高饲料的适口性。

研究表明，苜蓿鲜草中的非蛋白氮占总蛋白的8%～18%，而青贮之后的苜蓿中非蛋白氮占总蛋白的比例可达到44%～87%[5]，这是因为在青贮发酵过程中，大量的蛋白质被降解成为非蛋白氮。青贮饲料中的蛋白质变化，除了与梭菌等有害菌的活动有关，更主要的是植物中所含的蛋白质水解酶的作用[18]。McKersie[19]的研究结果表明苜蓿中的蛋白酶最适宜pH值为6.0，酶的活性会随着pH值的下降而降低，由于pH值影响蛋白酶的活性，保证较低的pH值环境能够抑制蛋白酶的活性。本试验结果与此一致，当现蕾期苜蓿未使用添加剂时，其贮料的pH达到5.55，同时非蛋白氮的含量也高达67.80%，而在LP+C100和FA+PRA处理组中，非蛋白氮的含量显著下降。PC组分属于不可利用的蛋白，其含量越低，蛋白质的生物学效价越高。PB2和PB3组分在瘤胃中的降解速率分别属于中速和慢速，其部分可以进入小肠，形成瘤胃蛋白，对提高家畜的生产性能具有较大的作用[20]。本试验中，LP+C100和FA+PRA处理均显著地降低了青贮料中PC的含量，增加了可利用的PB组分含量，而LP+C50在抑制蛋白质降解方面不显著，这说明增加纤维素酶的使用量可以更显著地抑制蛋白质的降解，这与Pys等[21]的结果一致。FA+PRA抑制蛋白质分解的效果明显优于LP+C，这可能是因为蛋白质降解速度在贮藏后第1天最快，且前7 d降解均较为激烈[22]，而生物添加剂不能如有机酸添加剂一样快速降低pH从而抑制蛋白质降解。

4 结论

与现蕾期刈割的苜蓿相比，初花期刈割苜蓿的青贮饲料发酵品质和营养价值更高。添加乳酸菌+纤维素酶和甲酸+丙酸均能够降低苜蓿青贮饲料的pH值、丁酸和氨态氮的产量，显著地降低非蛋白氮和结合蛋白质的产量，增加真蛋白的含量。综合而言，甲酸+丙酸处理组苜蓿青贮料的品质最佳，乳酸菌+纤维素酶(105cfu/g+100 mg/kg)次之。

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Effects of cutting stage and additives on the fermentation quality and CNCPS protein fractions of alfalfa silage

LI Zhen-Zhen1, BAI Chun-Sheng2, YU Yi-Dong3, YU Zhu1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 2.CollegeofHorticulture,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China; 3.AgricultureandAnimalHusbandryBureauofEerduosiCity,Eerduosi017000,China

The effect of microbial and chemical additives on the quality of alfalfa silage were tested in this study. Alfalfa was harvested at budding and early-flowering stage and wilted to approximately 70% moisture content and treated with four additive treatments; distilled water (control), 105cfu/gLactobacillusplantarumand 50 mg/kg cellulase (LP+C50), 105cfu/gL.plantarumand 100 mg/kg cellulose (LP+C100) and 6 mL/kg formic acid+propionic acid (FA+PRA), with 3 replications. Silages were analyzed after 30 d of ensiling. This study indicated that alfalfa harvested at the early flowering stage had lower pH (P<0.05), butyric acid (BA) and NH3-N (P<0.01) than those harvested at budding with significantly less non-protein nitrogen (PA) and unusable protein (P<0.01). All three additives significantly increased the fermentation quality of alfalfa by decreasing the pH and content of NH3-N (P<0.01). Alfalfa silage treated with LP+C had significantly higher lactic acid and lactic acid/acetic acid (P<0.01) while BA was not detected in the FA+PRA treatment. All additives had higher water soluble carbohydrate (WSC) and crude protein (CP) and less neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) (P<0.01) than the control. Applying LP+C100and FA+PRA markedly decreased the concentration of non-protein nitrogen and unusable protein, and increased the content of true protein in silages (P<0.01). The results suggest that alfalfa silage treated with FA+PRA had the highest quality, followed by LP+C100treated silage.

cutting stage; additives; alfalfa; silage quality; CNCPS (cornell net carbohydrate and protein system)

10.11686/cyxb2016029

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-01-20；改回日期：2016-03-25

国家牧草产业技术体系(CARS-35)，公益性行业(农业)科研专项(201303061)(201403048)，天津市农业科技成果转化与推广项目(201404040)和内蒙古自治区科技计划项目(苜蓿混合青贮调制技术研究与示范)资助。

李真真(1990-)，女，河南巩义人，在读硕士。E-mail: zhenzhenli5048@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yuzhu3@sohu.com

李真真，白春生，余奕东，玉柱. 刈割期及添加剂对苜蓿青贮品质及CNCPS蛋白组分的影响. 草业学报, 2016, 25(11): 167-172.

LI Zhen-Zhen, BAI Chun-Sheng, YU Yi-Dong, YU Zhu. Effects of cutting stage and additives on the fermentation quality and CNCPS protein fractions of alfalfa silage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 167-172.