亚硝酸根的2，3-二氨基吩嗪荧光猝灭法测定

翟马跃，梁淑彩，潘宇，刘羽萍，谭支林，刘凡，鄢国平*

1.武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北　武汉　430074；2.武汉大学药学院，湖北　武汉　430074

亚硝酸根的2，3-二氨基吩嗪荧光猝灭法测定

翟马跃1，梁淑彩2*，潘宇1，刘羽萍1，谭支林1，刘凡1，鄢国平1*

1.武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北武汉430074；2.武汉大学药学院，湖北武汉430074

2，3-二氨基吩嗪（DAP）在中性环境中具有强荧光.发现其在酸性介质中能与亚硝酸根离子反应，生成产物在中性环境下荧光很弱，据此建立了一种以DAP为探针，荧光猝灭测定水样中亚硝酸根离子的方法.在最佳测定条件下（0.03 mol/L的硫酸，2.0×10-3mol/L十六烷基三甲基溴化铵，反应温度50℃、反应时间50 min，激发和发射波长分别为435 nm和557 nm），体系荧光强度变化与亚硝酸根浓度在0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L范围内呈线性关系，检测限为9.8×10-8mol/L.该方法具有操作简便、灵敏度高、长波长下检测及斯托克位移大的优点.

荧光分析法；亚硝酸盐；2，3-二氨基吩嗪；胶束增敏

1　引言

亚硝酸盐广泛存在于土壤、水以及食品等物质中［1］，应用于工、农业以及食品添加剂等方面.其大量应用导致环境污染如水体富营养化、地下水污染等，而摄入过量的亚硝酸盐更是能使人体中毒，严重者甚至会导致死亡［2］.因此，亚硝酸根离子的检测具有十分重要的意义.荧光分析法操作方便、灵敏度高、反应速度快、对环境污染小［3］，是测量亚硝酸根离子的重要分析方法.

荧光法测定亚硝酸盐大多是基于探针上的胺基与亚硝酸根离子在酸性条件下的重氮化或者亚硝化反应从而使得探针的荧光增强或猝灭.如紫脲酸铵［4］、吲哚［5］、中性红［6-7］、藏红T［8］、品红［9］、荧光素［10-11］、酪氨酸［12］、叶酸［13］等荧光探针都是基于此机理来测定亚硝酸盐的.含邻二胺基团的荧光探针可与亚硝酸盐反应生成三氮唑化合物，如乙二胺［14］、2，3-二氨基萘［15］等，这类荧光探针一般具有更低的检测限与更宽的线性范围.此外有些物质如十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠等的加入，可使体系荧光大大增强，从而降低了体系的检测限，起到胶束增敏的作用.

本文采用含邻二胺基团的2，3-二氨基吩嗪（DAP）作为荧光探针（其结构如图1所示），以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作为增敏剂，建立了胶束增敏荧光猝灭测定亚硝酸盐的新方法，并将其用于湖水、雨水和自来水的实际检测.

图1　DAP的结构式Fig.1Structure of DAP

2　实验部分

2.1试剂及仪器

AR1104电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；F-4600荧光分光光度仪（日立高新技术公司）.

DAP根据文献［16］合成.DAP溶液：用DMSO溶解配制成浓度为1.0×10-2mol/L的储备液，置于冰箱保存，临用时用水稀释；亚硝酸钠溶液：用水溶解配置成0.1 mol/L的储备液，冰箱保存，需每天新配；硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠均配成1.0 mol/L溶液.所有试剂均为分析纯，东湖水等实际样品需过滤使用，实验用水为超纯水.

2.2方法

2.2.1DAP与亚硝酸根离子反应荧光变化在10 mL比色管中依次加0.3 mL硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP（储备液稀释后成1.0×10-4mol/L），适量亚硝酸根溶液，加水定容至5 mL，50℃下反应50 min，加入0.6 mL氢氧化钠，再次定容至10 mL，同时作空白试验.选择狭缝宽度为10 nm×20 nm，激发波长为435 nm，发射波长为557 nm，测定溶液荧光强度.

2.2.2硫酸浓度影响比色管中分别加不同量的硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亚硝酸根溶液（1.0×10-5mol/L），定容至5 mL，50℃下反应50 min，加氢氧化钠至pH为中性，定容至10 mL，同时作空白试验.在狭缝宽度为10 nm× 15 nm（后面实验均在此狭缝下测定），激发波长λex=435 nm、发射波长λem=557 nm的条件下测定其荧光强度变化△F（△F=F空白-F）.

2.2.3CTAB浓度影响比色管中分别加0.3 mL硫酸溶液，不同量CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亚硝酸根溶液，定容至5 mL，50℃下反应50 min，加入0.6 mL氢氧化钠，定容至10 mL，同时作空白试验.测定加入不同量CTAB的荧光强度变化△F.

2.2.4时间依赖性及温度影响比色管中分别加入0.3 mL硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亚硝酸根溶液，定容至5 mL，不同温度下反应，加入0.6 mL氢氧化钠，定容至10 mL，同时作空白试验.测定不同温度（25℃、37℃、50℃）反应不同时间的△F.

2.2.5工作曲线、检测限与精密度在所选择的最佳条件下（DAP浓度为2×10-6mol/L、硫酸浓度为0.03 mol/L、CTAB浓度为2.0×10-3mol/L、温度为50℃，反应时间50 min），配置一系列不同浓度的亚硝酸根溶液，测定线性范围，并根据公式LOD=kS0/S（S0为空白标准偏差，S是工作曲线斜率，k=3）计算检测限.在最佳条件下加入1.0 mL亚硝酸根溶液，重复6次，计算相对标准偏差.

2.2.6离子干扰在最佳实验条件下（CDAP=2× 10-6mol/L，CH2SO4=0.03 mol/L，CCTAB=2.0×10-3mol/L），亚硝酸根离子浓度为1.5×10-6mol/L时，考察其它离子（Cu+、Pb2+、Ni2+、Li+、Al3+、Mn2+、Cd2+、Hg2+、Ag+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Cl-、I-、NO3-、Ac-）能够共存的最大浓度.

2.2.7实际样品测试在最佳实验条件下加入实际样品（自来水加入量为3 mL，雨水2 mL，东湖水为1 mL），加标组再加入8.0×10-7mol/L的亚硝酸根溶液，测定各组荧光强度变化，平均测定3次，并计算样品中亚硝酸根离子含量和加标回收率.

3　结果与讨论

3.1荧光光谱

DAP在溶液pH小于6时基本无荧光，此后随着pH增加，荧光逐渐增强，最大激发波长为435 nm，发射波长为557 nm.在pH为7～8时荧光强度基本稳定；在pH大于8时荧光强度随pH值增大而减小.在酸性条件下，DAP能与亚硝酸根离子反应，产物在酸性条件下荧光较弱，加碱中和后荧光强度也无明显增强.因此，可以在酸性条件下使亚硝酸根离子和DAP反应，在中性条件下进行亚硝酸根离子测定.加入CTAB后体系荧光强度变化增强了十几倍，表明CTAB对测定有增敏作用.另外，加入CTAB后激发波长会小幅度发生红移，波长由425 nm移至435 nm处，发射波长基本不变.

图2是CTAB存在下DAP与亚硝酸根离子反应前后荧光光谱图，其中1和1’是DAP的激发和发射波长，2和2’是与亚硝酸根离子反应后的激发与发射波长.由图2可知，在激发波长为435 nm，发射波长为557 nm时，DAP荧光强度很大，加入亚硝酸根离子后荧光明显发生猝灭.说明DAP能对亚硝酸根离子做出响应.

图2　DAP与亚硝酸根离子反应前后荧光光谱图Fig.2Fluorescence spectra of DAP before and after reacting with nitrite

3.2酸性介质及其浓度影响

在相同实验条件下分别考察盐酸、硫酸、磷酸3种介质对体系荧光强度的影响.实验结果发现在硫酸介质中体系荧光强度变化△F最大，故选用硫酸作为酸性介质.不同浓度硫酸溶液对△F影响结果如图3所示，当硫酸浓度较小时，△F随酸度增大快速而增强，当硫酸浓度为0.03 mol/L时△F达到最大，之后△F基本不变，所以最终选择硫酸的最佳浓度0.03 mol/L.

图3　硫酸浓度对△F影响Fig.3Effect of sulfuric acid concentration on△F

3.3CTAB浓度影响

不同浓度CTAB溶液对△F影响如图4所示. CTAB浓度较小时，△F随其增大而快速增强，当CTAB浓度为2.0 mmol/L时达到最大，之后△F基本不变，所以最终选择2.0×10-3mol/L作为CTAB的最佳浓度.

图4　CTAB浓度对△F影响Fig.4Effect of CTAB concentration on△F

3.4时间依赖性及温度影响

如图5所示，DAP与亚硝酸根离子在25℃下反应较慢，120 min后反应仍不完全，而在37℃和50℃下，在反应时间小于15 min时△F迅速增大，在15 min至50 min时△F增加趋势变缓，在50 min时反应基本完全，且在50℃下的△F比在37℃下的△F稍高，故选择最佳反应温度为50℃，反应时间为50 min.

3.5工作曲线、检测限与精密度

如图6所示，亚硝酸根浓度在0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L范围内与△F呈良好的线性关系.其线性回归方程为：△F=249.2C+26.07（R2=0.999），其中C为亚硝酸根浓度，并根据公式LOD=kS0/S（空白标准偏差S0=8.2，工作曲线斜率S=249.2，k=3）计算出检测限为9.8×10-8mol/L.加入亚硝酸根离子的浓度为1.0 μmol/L时，按实验方法测定6次，相对标准偏差为1.5%.

图5　温度和时间对△F影响Fig.5Effect of temperature and time on△F

图6　工作曲线Fig.6Calibration curve

3.6其它离子干扰

在亚硝酸根浓度为1.5×10-6mol/L时，相对误差在±5%以内，允许1 000倍的Cu2+、Pb2+、Al3+、Mn2+、Cl-、NO3-、Ac-，500倍浓度的Ni2+、Li+、Cd2+、Hg2+，100倍的Co2+，50倍的Mg2+、Zn2+，5倍的I-，2倍浓度的Ag+，1倍浓度的Ba2+与亚硝酸根离子共存.

3.7实际样品测定

表1是实际样品的亚硝酸根离子含量测定值与加标回收率（三种试样的加入量分别为3 mL、 1 mL和2 mL）.经计算可得，自来水、东湖水、雨水中亚硝酸根离子含量分别为1.10×10-6mol/L、3.43× 10-6mol/L、2.14×10-6mol/L.

表1　实际样品测定及加标回收率Tab.1Determination and recovery rates of nitrite in samples

4　结语

本文建立了基于2，3-二氨基吩嗪的荧光分析测定亚硝酸根离子的方法.在最佳实验条件下的线性范围为0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L，检测限为9.8×10-8mol/L.该方法测定灵敏度高、斯托克位移大，有望用于实际样品中亚硝酸根离子的测定.

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本文编辑：张瑞

Determination of Nitrite with 2，3-Diamino-Phenazine by Fluorescence Quenching Method

ZHAI Mayue1，LIANG Shucai2*，PAN Yu1，LIU Yuping1，TAN Zhilin1，LIU Fan1，YAN Guoping1*
1.School of Materials Science and Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430074，China

The 2，3-Diamino-phenazine（DAP）has strong fluorescence in the neutral medium.We found that it could react with nitrite in acidic medium，and the produce displayed weak fluorescence in the neutral medium，thus a fluorimetric quenching method for the detection of nitrite in water samples was developed employing DAP as fluorescence probe.Upon the optimum experimental conditions（0.03 mol/L of H2SO4，2.0×10-3mol/L of hexadecyl trimethyl ammonium bromide，reaction temperature of 50℃，reaction time of 50 min，fluorescence detected at 557nm with the excitation wavelength of 435 nm），the fluorescence change was linear to nitrite concentration over the range of 0.1 mol/L-2.1×10-6mol/L with the detection limit of 9.8×10-8mol/L.The proposed method possessed the characteristics of simpleness，sensitivity，long detection wavelength and large Stocks shift.

fluorescence analysis；nitrite；2，3-diamino-phenazine；micellar sensitization

O657.3

A

10.3969/j.issn.1674⁃2869.2016.05.004

1674-2869（2016）05-0431-06

2016-05-10

国家自然科学基金面上项目（51373128，51173140）；武汉市高新技术产业科技创新团队培养计划项目（2013010501010131）；武汉工程大学研究生教育创新基金项目（CX2015007，CX2014058）；武汉工程大学第十期大学生校长基金项目（2015004）

翟马跃，硕士研究生.E-mail：zmyysyy@163.com

鄢国平，博士，教授.E-mail：guopyan2006@163.com梁淑彩，博士，副教授.E-mail：chirolab@gmail.com