RNA干扰下调CD98hc表达对胶质瘤细胞U251增殖、转移的影响

苗锐　赵耀　杨荣军　高兴春　郭娜

1.陕西省第二人民医院神经内科,陕西西安710005；2.西安医学院免疫学教研室,陕西西安710021

RNA干扰下调CD98hc表达对胶质瘤细胞U251增殖、转移的影响

苗锐1赵耀1杨荣军1高兴春2郭娜2

1.陕西省第二人民医院神经内科,陕西西安710005；2.西安医学院免疫学教研室,陕西西安710021

目的观察下调CD98hc对胶质瘤U251细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。方法应用siRNA技术干涉U251胶质瘤细胞CD98hc的表达,筛选并获得CD98hc低表达的U251细胞株（U251KD)及阴性对照细胞（U251NC)。流式细胞技术及Western blot鉴定CD98hc的表达下调情况。应用CCK-8细胞增殖实验检测两组细胞增殖；细胞划痕实验及Transwell小室分别检测两组细胞的迁移及侵袭能力；Western blot检测MMP-2、MMP-9的表达。结果与阴性对照U251NC组相比,U251KD细胞中CD98hc水平明显下调（P＜0.01),U251KD细胞的增殖和迁移、侵袭能力均显著受抑（P＜0.05),MMP-2、MMP-9的表达也明显降低（P＜0.01)。结论下调CD98hc的表达能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭,其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关。CD98hc分子可作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。

CD98分子;胶质瘤;细胞增殖;细胞侵袭

神经胶质瘤是好发于成人的一种原发性中枢神经系统肿瘤,50%以上的胶质瘤具有分化程度低、侵袭性强、恶性程度高等特点,临床预后较差[1]。临床胶质瘤的治疗多采用手术并辅以放/化疗的综合治疗方式[2],但患者的生存期仍然较短,效果并不理想[3-4],这主要与胶质瘤复杂的发病机制密切相关。多项研究表明,神经胶质瘤的发生发展是一个涉及多基因、多阶段的过程,因此,阐明其发病的分子机制对胶质瘤的治疗具有重要的指导意义。

CD98分子是由CD98重链（CD98hc、4F2hc)与LAT-1、LAT-2等6种轻链中的一条组成的异源二聚体,在细胞氨基酸代谢转运方面发挥着重要的作用[5]。越来越多的研究发现,CD98hc在多种肿瘤细胞表面呈高表达,与肿瘤的发生发展关系密切[6]。在人脑胶质瘤中CD98hc的表达明显高于正常脑组织,并且其表达水平与胶质瘤的病理分级呈显著正相关[7]。但是CD98hc在胶质瘤发生发展中的具体作用机制目前尚未见报道。本文主要通过干涉CD98hc的表达,观察其对胶质瘤细胞系U251的增殖和运动能力的影响,并初步探讨其机制,旨在为胶质瘤的基因治疗提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

U251细胞株购自中科院细胞库；DMEM（美国Hyclone)；小牛血清（四季青)；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所)；Transwell小室（Corning公司)；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司)；鼠抗CD98单克隆抗体、鼠抗MMP-2抗体、兔抗MMP-9抗体（Abcam)；抗人βactin小鼠单克隆抗（Santa Cruz)；羊抗鼠FITC（中杉公司)；二抗（Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养U251细胞培养于含10%FBS、2% L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中,置于37℃、5%CO2培养箱,适时更换培养基和传代。实验时选取处于对数生长期的细胞。

1.2.2U251细胞转染取对数生长期的U251细胞2× 105接种于6孔板中,继续培养,待融合度达80%左右,按质粒（μg):脂质体（μL)=1:2的比例转染CD98hcsiRNA、空白对照（control siRNA),具体操作按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行,分别获得CD98下调的U251KD细胞株和阴性对照U251NC细胞株。培养48 h后收集细胞进行Western blot和流式细胞技术鉴定,鉴定成功后用于后续实验。

1.2.3Western blot检测收集待检测细胞,RIPA裂解提取蛋白,BCA蛋白定量后进行10%SDSPAGE凝胶电泳,湿转至PVDF膜后,应用5%脱脂牛奶封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,PBST洗膜3次后加入二抗,室温孵育1 h后,洗膜3次,化学发光,采集图像。

1.2.4流式细胞染色收集转染后的U251细胞,制成细胞混悬液,浓度为1×106/mL,4%多聚甲醛固定20 min后,1%BSA室温封闭20 min,加入鼠抗CD98单抗室温孵育1 h,PBS洗3次后加入羊抗鼠FITC室温1 h, PBS漂洗后上机检测。

1.2.5CCK-8检测细胞增殖收集转染后的U251细胞,每孔1×104个细胞接种于96孔板中,于固定时间点（6、12、24、48、72、96 h)向每孔中分别加入10 μL CCK-8溶液孵育,1 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.6细胞划痕实验收集细胞,在12孔板中每孔加入4×105个细胞。待细胞贴壁后用中枪头比着直尺呈45°划痕。用无血清培养基洗细胞2次,去除划下的细胞,加入无血清培养基,分别在培养的0、12、24 h拍照。计算2次拍照间的距离差,实验重复3次,计算平均值。

1.2.7Transwell侵袭实验无血清培养基按1:4稀释Matrigel胶,加入小室上室,每个小室100 μL,37℃孵育4 h。加入细胞前先水化基底膜。消化细胞并计数,浓度为1×105/mL,加入100 μL于小室上室。在小室的下室24孔板内加入400 μL含10%血清的培养基,37℃,5%CO2培养24 h。每组设3个平行复孔。取出小室,弃去培养基,置于未用过的24孔中,95%乙醇固定后加入DAPI染色10 min,10×荧光显微镜下观察,拍照。计数5个视野的穿膜细胞数,实验重复3次,计算平均值。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差（x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Student's t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1U251细胞表面CD98hc的下调表达

Western blot结果显示,U251KD细胞CD98的表达明显下调,蛋白抑制率达56.9%,显著低于阴性对照U251NC细胞（P＜0.001),见图1A；同时,流式结果显示,U251KD细胞表面CD98表达量亦明显低于U251NC细胞（P＜0.001),见图1B。

2.2下调表达CD98分子抑制U251细胞增殖

应用CCK-8法检测CD98分子对U251细胞的增殖影响,结果发现,U251KD细胞增殖活性与U251NC细胞相比,24 h后两组细胞OD值差异有统计学意义（P＜0.05),见图2。提示CD98分子可显著抑制U251细胞的体外增殖。

2.3下调表达CD98分子抑制U251细胞迁移

体外细胞划痕实验结果表明,下调CD98的表达后,U251细胞的迁移运动能力明显受抑。U251KD细胞与U251NC细胞相比,在12 h即表现出显著的迁移抑制（P＜0.05),24 h作用更加明显（P＜0.001)。见图3。

2.4下调表达CD98分子抑制U251细胞侵袭

分别将U251KD细胞与U251NC细胞接种于Transwell小室上室培养24 h,DAPI染色后于显微镜下观察,发现两组均有细胞穿过小室滤膜。U251KD细胞与U251NC细胞相比,穿膜细胞数明显减少,差异有高度统计学意义（P＜0.01)。提示下调U251细胞的CD98表达对U251细胞的侵袭能力存在一定的抑制作用。见图4。

2.5下调CD98分子抑制U251细胞MMP-2、MMP-9的表达

图1　Western blot及流式细胞术检测U251细胞CD98干涉情况

图2　CCK-8检测CD98分子对U251细胞的增殖抑制作用

图3　干涉CD98显著抑制U251细胞的迁移能力

图4　下调CD98显著抑制U251细胞侵袭能力

进一步收集转染后的U251NC和U251KD细胞,检测其MMP-2和MMP-9表达,结果显示,下调CD98后,胶质瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达均明显下调,与阴性对照U251NC细胞相比,差异有高度统计学意义（P＜0.01)。见图5。

图5　干涉CD98后对U251细胞系MMP-2、MMP-9的影响

3　讨论

CD98分子最早被认为是一种淋巴细胞表面抗原,与T细胞和B细胞的激活相关[8]。后来研究发现,CD98广泛表达于除血小板以外的所有细胞,并且在处于增殖状态的正常组织中呈高表达。对增殖活跃的肿瘤细胞而言,CD98分子已被证实高表达于肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤组织中,这种高表达与患者的病情及预后密切相关[9-11]。在胶质瘤中,也有类似的研究,这些研究提示CD98hc高表达于脑胶质瘤中,而瘤旁组织则无明显表达,并且其高表达与胶质瘤的病理分级和恶性增殖显著相关[12-13]。本研究发现,抑制CD98hc的表达可以明显抑制U251细胞的增殖,这和在其他肿瘤上的研究结果基本一致[14-16],提示CD98hc在人脑胶质瘤发生和发展中起着重要作用,可作为肿瘤治疗的一个潜在靶点。

侵袭性生长是脑胶质瘤细胞的一个非常显著的特点,这也成为胶质瘤治疗中需要克服的一个瓶颈。本研究发现,下调CD98分子可以显著降低U251细胞的迁移及侵袭能力,进一步分析其具体机制发现,CD98的下调可引起基质金属蛋白酶（MMP)-2和MMP-9的表达降低,提示CD98分子在胶质瘤的侵袭扩散中起到了非常重要的作用。有研究表明,随着胶质瘤恶性程度的增加,MMP-2的表达及活性也明显增加,并与胶质瘤的侵袭直接相关[17]。然而CD98分子如何参与MMPs的表达调控目前还不清楚,笔者推测可能与CD147分子有一定的联系。CD147分子又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂,可以在肿瘤微环境中诱导MMPs的分泌,从而促进肿瘤侵袭和转移[18]。有文献报道,CD147和CD98hc可能作为一个分子复合体而存在于胞膜表面相互作用,组成CD147-CD98hc复合体进一步调节细胞的糖和氨基酸代谢,从而发挥对细胞的调控作用[19-20]。CD98分子可能通过调控CD147分子的功能进而影响MMPs的分泌,参与胶质瘤细胞的侵袭扩散,至于其具体机制有待于进一步研究。

综上所述,下调胶质瘤U251细胞CD98分子的表达可明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,其抑制胶质瘤细胞侵袭的机制可能与MMP-2和MMP-9的表达减少有关。本文从细胞水平证实了CD98分子在脑胶质瘤发生发展中的作用,为以CD98为靶点的胶质瘤基因治疗提供了初步实验依据。

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Effect of RNA interference down-regulation of CD98hc on proliferation, migration of U251 cells

MIAO Rui1ZHAO Yao1YANG Rongjun1GAO Xingchun2GUO Na2
1.Department of Neurology,the Second People's Hospital of Shaanxi Province,Xi'an710005,China;2.Department of Immunology,Xi'an Medical University,Shaanxi Province,Xi'an710021,China

Objective To observe the effect of down-regulation of CD98hc on proliferation,migration and invasion of U251 cells.Methods siRNA technology was used to interference CD98hc in U251 cells.CD98hc low expression U251 cells(U251KD)and the negative control cells(U251NC)were obtained.FCM and Western blot were used to verify the down-regulation of CD98hc.CCK-8 assay was used to test the cell proliferation of both U251KD and U251NC cells. Wound scratch assay and Transwell assay were conducted to determine the migration and invasion potency of U251KD and U251NC cells.Western blot was used to detect the expression of MMP-2 and MMP-9.Results Compared to that of U251NC cells,CD98hc was down-regulated significantly in U251KD cells(P＜0.01).The cell proliferation,migration and invasion potency were significantly inhibited in U251KD cells(P＜0.05);suppressing CD98hc expression also down-regulated the expression of MMP-2 and MMP-9(P＜0.01).Conclusion Knocking down of CD98hc inhibits the proliferation,migration and invasion of U251 cells in vitro,and the mechanism may be associated with the down-regulation of MMP-2 and MMP-9.CD98hc can act as a potential target in glioma therapy.

CD98;Glioma;Cell proliferation;Cell invasion

R730.23

A

1673-7210(2016)06(b)-0016-05

西安医学院博士科研启动基金项目（2015DOC 08)；西安医学院分子免疫学重点学科建设经费。

苗锐（1980-),男,硕士研究生；研究方向:脑血管疾病的防治。

郭娜（1982-),女,博士研究生,副教授；研究方向:肿瘤生物学。

（2016-03-11本文编辑:程铭)