川芎赤芍对脑缺血大鼠血管生成素及低氧诱导因子表达的影响

马进　甘雨　袁媛　黄赫　乔铁　刘曼玉　褚丽　田淼淼

1.辽宁中医药大学附属第二医院脑一科,辽宁沈阳110034；2.辽宁中医药大学方剂教研室,辽宁沈阳110032

川芎赤芍对脑缺血大鼠血管生成素及低氧诱导因子表达的影响

马进1甘雨1袁媛1黄赫1乔铁2刘曼玉2褚丽2田淼淼2

1.辽宁中医药大学附属第二医院脑一科,辽宁沈阳110034；2.辽宁中医药大学方剂教研室,辽宁沈阳110032

目的探讨川芎赤芍对脑缺血再灌注大鼠血管生成素-1（Ang-1)及低氧诱导因子-1α（HIF-1α)表达的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组,以“Zea Longa线栓法”造成脑缺血再灌注大鼠模型。假手术组、模型组给予生理盐水,川芎赤芍组给予川芎赤芍提取液,尼莫地平组给予尼莫地平溶液,酶联免疫吸附测定（ELISA)法测定大鼠血清Ang-1水平,实时荧光定量PCR法检测HIF-1α mRNA的表达。结果ELISA法测定大鼠血清Ang-1显示:给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平较假手术组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义（P＜0.05)。实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA显示:给药3、7、14 d,模型组HIF-1α mRNA表达较假手术组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,模型组HIF-1α mRNA表达水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义（P＜0.05)。结论川芎赤芍可显著升高血清中Ang-1水平及脑组织中HIF-1α mRNA的表达,其治疗脑梗死可能与促进脑血管新生有关。

脑缺血;血管生成素-1;低氧诱导因子-1α;川芎;赤芍

脑梗死是由于脑局部血液供应障碍,引起病变血管供血区脑组织缺血、缺氧、坏死,引起一系列生理、生化与病理的级联反应,如兴奋毒性、细胞凋亡、自由基损害等。临床研究发现,脑梗死患者生存时间以及预后与梗死后脑组织的微血管密度呈正相关,缺血区周边微血管密度高的患者比密度低的患者生存期长,预后好[1-2],因此血管新生作为改善脑组织血流供应的一种有效方法,对脑梗死患者的预后十分关键。川芎赤芍是经典名方经常一起使用的药对,两药临床常配伍运用,具有行气活血的功效,现代研究提示二者对脑缺血有调节作用。本研究探讨川芎赤芍配伍应用对脑缺血再灌注大鼠血管生成素-1（Ang-1)及低氧诱导因子-1α（HIF-1α)的影响,并与尼莫地平片进行比较分析,探讨川芎赤芍配伍治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

雄性SD大鼠96只,周龄8～10周,体重（250± 30)g,购于辽宁长生生物技术有限公司,动物合格证号:211002300010781,动物许可证号:SCXK（辽) 2015-0001。大鼠饲养在辽宁中医药大学附属第二医院（以下简称“我院”)实验动物中心,温度20～23℃,相对湿度50%～60%。按照随机数字表将其分为假手术组、模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组,每组24只。假手术组、模型组分别给予生理盐水、川芎赤芍组予川芎赤芍提取液,尼莫地平组予尼莫地平液,每日2次,连续给药。

1.2实验药物与试剂

川芎和赤芍由我院临床药学实验室制成汤剂备用。川芎、赤芍提取液浓度为1.08 g生药/mL。阳性对照药尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司,批号: 150166),尼莫地平片配制成浓度1.08 mg/mL的溶液。Ang-1酶联免疫吸附测定（ELISA)试剂盒（北京诚林生物科技有限公司,批号:E-30570)；MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue（Roche,批号:12234000)。

1.3主要仪器

罗氏全自动核酸提取系统（Roche,MPLC2.0)；实时荧光定量PCR仪（Roche,LC480)；罗氏组织匀浆仪（Roche,LR56495)；电热恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂,出厂编号:82062)；低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司,型号:TD5A-WS)。

1.4模型制备

线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型[3]:3%水合氯醛腹腔注射麻醉后,SD大鼠仰卧固定于手术台上,颈部正中切口,暴露右侧颈总动脉,分离颈内、外动脉,在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉,右侧颈总动脉处剪口,插入头端圆钝直径为0.28 mm的MCAO栓线,进栓线长度18～19 mm,在大脑中动脉起始端线栓大鼠大脑中动脉。栓塞2 h后取出MCAO栓线。

1.5取材与标本处理

各组于给药第3、7、14天分别处死大鼠8只。处置方法:3%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉取血,每次取血4～5 mL,全血放在室温中静置30 min左右后3000 r/min,离心10 min,用移液器分离血清至EP管中,记号笔标上记号,放入-20℃冰箱中冻存备用。取血后将各组大鼠断头处死,立即取出脑组织后除去嗅球、小脑、脑干,取出右侧缺血脑组织,置-80℃冰箱进行冻存。

1.6脑梗死面积(TTC染色)

将各组大鼠在7 d后进行断头取脑,去除嗅球、小脑、低位脑干,大鼠用3%水合氯醛麻醉后,断头取脑,将大鼠大脑置于-20℃冷冻20 min后,去掉嗅球、小脑和低位脑干,冠状切分脑组织成5片。用2%的红四氮唑将脑片染色,37℃培养箱中避光染色30 min,期间不断翻转脑片,使两面染色均匀。正常脑组织呈红色,而梗死脑组织则为白色。

1.7观察指标

采用ELISA法测定大鼠血清Ang-1水平,采用实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织HIF-1α的表达情况。

1.8统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析处理,计量资料数据采用均数±标准差（±s)表示,经方差齐性检验和正态性检验,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD法检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组脑梗死面积比较

假手术组:大脑红染,未发现任何白色梗死区域；模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组各组均出现不同面积的白色梗死灶,模型组梗死面积最大,川芎赤芍组、尼莫地平组白色梗死灶面积较模型组明显减小,差异有统计学意义（P＜0.05)。见表1、图1。

表1　各组脑梗死面积百分比的比较（%,±s)

表1　各组脑梗死面积百分比的比较（%,±s)

注:与模型组比较,*P＜0.05；与假手术组比较,#P＜0.05

组别只数7 d后梗死面积假手术组模型组川芎赤芍组尼莫地平组8 8 8 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 2 9 . 5 0 ± 4 . 0 3 1 4 . 6 4 ± 5 . 7 7*#1 0 . 9 3 ± 2 . 2 8*#

图1　TTC染色大鼠脑切片

2.2各组血清血管生成素-1水平比较

给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平较假手术组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,川芎赤芍组、尼莫地平组Ang-1水平较假手术组显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05),提示川芎赤芍对脑缺血损伤有治疗作用,可能是通过调节与血管再生有关因子的变化,改善了侧支循环的建立。见表2。

表2　各组血清血管生成素-1水平比较（pg/mLs)

表2　各组血清血管生成素-1水平比较（pg/mLs)

注:与模型组比较,*P＜0.05；与假手术组比较,#P＜0.05

组别只数3 d 7 d 1 4 d假手术组模型组川芎赤芍组尼莫地平组8 8 8 8 2 3 3 . 6 3 ± 5 3 . 0 0*3 7 1 . 0 0 ± 6 5 . 1 7 4 5 4 . 1 3 ± 8 7 . 6 0*#4 4 6 . 3 8 ± 6 7 . 0 8*#2 4 9 . 3 8 ± 4 4 . 9 6*4 0 1 . 1 3 ± 3 9 . 1 9 4 6 7 . 2 5 ± 6 7 . 3 6*#4 5 5 . 7 5 ± 5 6 . 1 1*#2 5 6 . 8 8 ± 4 3 . 4 4*3 7 6 . 0 0 ± 7 0 . 8 4 4 4 5 . 8 8 ± 5 9 . 9 6*#4 3 6 . 0 0 ± 5 7 . 9 7*#

2.3各组缺血脑组织中HIF-1α mRNA相对表达量水平变化比较

给药3、7、14 d,模型组HIF-1α mRNA表达较假手术组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,模型组HIF-1α mRNA表达水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义（P＜0.05)；给药3、7、14 d,川芎赤芍组、尼莫地平组HIF-1α mRNA含量较假手术组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05)。模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组给药7 d HIF-1α mRNA含量与本组给药3 d时比较,差异均有统计学意义（P＜0.05),模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组给药14 d HIF-1α mRNA含量与本组给药3 d时比较,差异无统计学意义（P＞0.05)。见表3。

表3　各组缺血脑组织中HIF-1a mRNA相对表达量水平变化比较（±s)

表3　各组缺血脑组织中HIF-1a mRNA相对表达量水平变化比较（±s)

注:与模型组比较,*P＜0.05；与假手术组比较,#P＜0.05；与本组给药3 d比较,△P＜0.05

组别只数3 d 7 d 1 4 d假手术组模型组川芎赤芍组尼莫地平组8 8 8 8 1 . 0 9 ± 0 . 1 2*1 . 2 3 ± 0 . 0 7 1 . 4 3 ± 0 . 0 8*#1 . 3 2 ± 0 . 0 7*#1 . 0 8 ± 0 . 1 2*1 . 3 7 ± 0 . 0 9△1 . 6 0 ± 0 . 1 0*#△1 . 5 1 ± 0 . 0 8*#△1 . 1 2 ± 0 . 0 8*1 . 3 3 ± 0 . 0 6 1 . 5 2 ± 0 . 0 7*#1 . 3 7 ± 0 . 0 7*#

3　讨论

血管生成素（Ang)是一族蛋白质分子,Ang-1是该家族成员之一,主要表达在血管旁细胞。通过Tie-2的磷酸化,Ang-1触发血管周细胞和血管内皮细胞之间的相互作用,从而促进新生血管的稳定和重塑。Ang/Tie信号通路在生理性、病理性血管生成过程中均发挥着重要的作用。Ang-1在血管新生过程中发挥重要作用。Ang-1和受体Tie-2相结合后,活化的内皮细胞能吸引血管平滑肌细胞和周细胞等形成完整的血管壁,促进血管新生[4-6]。Ang-1可以通过增加血管内皮细胞间连接的紧密性,减少血管的渗漏,从而减轻炎性反应。庄越等[7]发现Ang-1可能通过减轻脑血管炎性反应过程和维持血管内皮细胞完整性来减轻脑血管内皮细胞缺血再灌注损伤,从而起到保护作用。任虹宇等[8]结果提示,神经干细胞移植能够有效促进脑出血恢复期大鼠神经功能的恢复,其机制可能与增加出血周围脑组织促血管生成素及酪氨酸激酶受体2的含量有关。Ang-1是一种能够抵抗血管渗漏的内源性蛋白质因子,它能抵抗炎症以及血管内皮生长因子（VEGF)引起的血管渗漏,对VEGF促血管新生的功能有促进和互补作用,且并不影响血管的正常形态,长期高浓度的Ang-1对健康无明显不利影响[9]。研究显示,大鼠脑缺血再灌注7 d后,大脑患侧皮层Ang-1和Tie-2蛋白表达升高,给予莫诺苷治疗后,Ang-1和Tie-2蛋白表达水平进一步增加[10]。电针“百会”“水沟”“后三里”能有效对抗脑缺血再灌注损伤,其作用机制可能与促进HIF-1α及VEGF在海马的表达、调节脑缺血再灌注后血管新生进程有关[11]。丹龙醒脑方能够促进脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织血管新生,对缺血脑组织具有保护作用,其作用机制可能与上调Ang-1蛋白表达有关[12]。大鼠脑缺血后VEGF、Ang-1和Ang-2共同协调作用促进血管生成,中药脑泰方在脑缺血损伤后治疗血管新生样作用中发挥着促进作用[13]。

1992年首次发现HIF-1,Semenza等[14]在缺氧诱导的Hep3B细胞核提取物中发现,它是由氧分压调控的α亚基和基础性表达的β亚基构成的异源二聚体。HIF-1是细胞与组织为适应低氧压力环境产生的转录因子。HIF-1的活性主要通过HIF-1α的蛋白水平来调节。氧分压正常时,HIF-1α被脯氨酸羟化酶快速羟基化,而后在蛋白酶体中降解；低氧分压时,PHD活性降低,HIF-1α在胞浆中蓄积,与HIF-1β结合形成HIF-1后进入细胞核,与低氧反应元件结合,调控下游靶基因表达。在机体对低氧代偿的调节机制中, HIF-1是重要的细胞转录因子,在细胞氧稳态的调节过程中起到了核心作用。缺氧是诱导HIF-1表达的强因素,在脑缺血条件下内皮细胞上的HIF-1 mRNA表达明显增加。HIF-1的活性对于组织缺血后的恢复是非常重要的。HIF-1可以通过上调与血管新生系统相关蛋白的基因表达,如促进血管生成的VEGF及其受体,如诱导型一氧化氮合酶血红素氧化酶-1等来增加血流,降低缺血损伤。HIF-1是细胞与组织为适应低氧环境所产生的转录因子。HIF-1通过调节一系列基因,参与了血管生成、葡萄糖代谢、铁代谢及细胞增殖与存活等。脑缺血缺氧时,HIF-1α表达增多可以增加血液、氧及营养的供应。有研究显示在大鼠中动脉闭塞模型基因敲除大鼠,HIF在神经元的激活经过了一个双相过程,在缺血后6 h达到高峰,1 d时下降,但2 d后又持续升高至8 d的时候再下降[15]。

研究表明川芎、丹参、当归、三七、红花这些活血化瘀药都有促血管新生和保护血管的作用,能增加血管密度,促进脑梗死急性期侧枝循环的建立,减少后遗症的发生[16-17]。通络救脑注射液及其有效组分栀子苷、三七总皂苷均可通过抗氧化作用有效减轻内皮细胞拟缺血损伤,提高细胞活性[18]。经检索《普济方》数据库管理系统,同时含川芎赤芍的方剂高达3546首[19],现代药理研究提示,两药合用对脑缺血有调节作用[20]。脑缺血后脑微血管的完整性对神经系统的损伤与修复有明显作用,川芎赤芍可能通过升高Ang-1水平及HIF-1α mRNA的表达,对脑缺血后微血管的修复新生起作用,进而起到改善脑微循环的作用。

[1]Krapinski J,Kaluza J,Kumar P,et al.Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke[J].Stroke,1994, 25（9):1794-1798.

[2]Marti HJ,Bemaudin M,Bellail A,et al.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression precedes neovascularization after cerebral ischemia[J].Am J Pathol, 2000,156（3):965-976.

[3]仲爱芹,徐士欣,张军平,等.改良法制备、评价大鼠局灶性脑缺血模型的实验研究[J].辽宁中医杂志,2012,39（6): 1176-1178.

[4]Lee SW,Kim WJ,Jun HO,et al.Angiopoietin 1 reduces vascular endothelial growth factor induced brain endothelial permeabilirty via upregulation of ZO-2[J].Int J Mol Med,2009,23（2):279-284.

[5]Huang J,Inoue M,Hasegawa M,et al.Sendaiviral vector mediated angiopoietin-1 gene transfer for experimental ischemic limb disease[J].Angiogenesis,2009,26（12):243-249.

[6]Scharpfenecker M,Fiedler U,Reiss Y,et al.The Tie2 ligand angiopoietin2destabilizesquiescentendothelium through an internal autocrine loop mechanism[J].J Cell Sci, 2005,118（4):771-780.

[7]庄越,金文香.血管生成素1对脑缺血再灌注损伤保护作用及其机制[J].中国神经精神疾病杂志,2014,40（5): 305-308.

[8]任虹宇,李明轩,何承,等.神经干细胞移植脑出血恢复期大鼠神经功能和促血管生成素1及受体的表达[J].中国组织工程研究,2015,19（32):5199-5203.

[9]Passos-Silva DG,Verano-Braga T,Santos RA.Angiotensin（1-7):beyond the cardio-renal actions[J].Clin Sci（Lond), 2013,124（7):443-456.

[10]刘婷婷,孙芳玲,程华,等.莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受体Tie-2的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21（1):9-11.

[11]余玲玲.电针对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马区VEGF、HIF-1α表达的影响[D].武汉:湖北中医学院, 2009.

[12]张秋雁,朱伟,徐瑾瑜,等.丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠血管新生及对Ang-1蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22（1):139-142.

[13]宋祯彦,周瑜,王珊珊,等.中药脑泰方对大鼠脑缺血后VEGF和Angiopoietins表达的实验研究[J].湖南中医药大学学报,2016,36（1):19-22.

[14]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoiet in gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol,1992,12（12): 5447-5454.

[15]Baranova O,Miranda LF,Pichiule P,et al.Neuron-specific inactivation of the hypoxia inducible factor 1 alpha increases brain injury in a mouse model of transient focal cerebral ischemia[J].J Neurosci,2007,27（23):6320-6332.

[16]张哲睿,黎晌,王佑华,等.三七及三七花总皂苷对斑马鱼模型促血管新生作用的研究[J].上海中医药大学学报,2013,27（1):45-49.

[17]董海燕,杨建刚,肖志强,等.4种中药和3个方剂促血管新生作用及有效组分的研究[J].中药材,2013,36（8): 1297-1300.

[18]郭晓谨,李兴广,李卫红,等.三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响[J].中国中医基础医学杂志,2014,20（2):215-216.

[19]梁茂新,黄会生.《普济方》数据库管理系统（软著登字第0002781号)[Z].北京:中华人民共和国版权局,1998.

[20]梁日欣,黄璐琦,刘菊福,等.药对川芎和赤芍对高脂血症大鼠降脂、抗氧化及血管内皮功能的实验观察[J].中国实验方剂学杂志,2002,8（1):43-45.

Influence of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on the expression of angiogenin and hypoxia inducible factor in rats with cerebral ischemia

MA Jin1GAN Yu1YUAN Yuan1HUANG He1QIAO Tie2LIU Manyu2CHU Li2TIAN Miaomiao2
1.The First Department of Cerebropathy,the Second Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang110034,China;2.Teaching and Research Section of Formulas of Chinese Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang110032,China

Objective To investigate the effect of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on expression of angiogenin-1(Ang-1)and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)in rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods SD rats were randomly divided into sham group,model group,Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group, Nimodipine group.The model of rat with cerebral ischemia was established with Longa line plug method.Rats in sham group and model group were given normal saline,rats in Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group were administrated with Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra extracting solution.Rats in Nimodipine group were administrated with Nimodipine Solution.Ang-1 in rat serum was tested with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)method.The expression of HIF-1α mRNA was detected with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR).Results Ang-1 in rat serum with ELISA method showed that:the Ang-1 levels of model group after administration for 3,7,14 days were increased compared with those of sham group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the Ang-1 levels of model group after administration for 3,7,14 days were lower than those of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group and Nimodipine group,the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of HIF-1α with RT-PCR showed that:the expression of HIF-1α of model group after administration for 3,7,14 days were increased compared with those of sham group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the expression of HIF-1α of model group after administration for 3,7, 14 days were lower than those of Rhizoma Chuanxiong and Radix PaeoniaeRubra group and Nimodipinegroup,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra can significantly enhance Ang-1 in serum and HIF-1α mRNA expression in brain tissue,suggesting that the mechanism of cerebral ischemia may be related to promoting angiogenesis.

Cerebral ischemia;Angiogenin-1;Hypoxia inducible factor-1α;Rhizoma Chuanxiong;Radix Paeoniae Rubra

R743.3

A

1673-7210(2016)06(b)-0008-05

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013362)。

马进（1976-),女,博士,中国中医科学院博士后,辽宁中医药大学杏林杰出青年,副主任医师,硕士研究生导师；研究方向:脑血管疾病中西医结合基础与临床研究。

（2016-02-19本文编辑:张瑜杰)