辽宁省北苍术病害调查及种类鉴定

徐海娇, 葛昕欣, 周如军, 傅俊范, 赵杰锋

(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)



辽宁省北苍术病害调查及种类鉴定

徐海娇, 葛昕欣, 周如军*, 傅俊范, 赵杰锋

(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)

北苍术(Atractylodeschinensis)为我国传统药用植物,具有较高的经济价值和药用价值，近年来在辽宁省东部山区大面积人工种植。为明确辽宁省北苍术主要病害种类及发生危害情况,降低人工驯化栽培可能面临的病害风险,本研究于2011-2015年对辽宁省抚顺、清原和新宾等7个主要北苍术种植区进行了系统调查。结果表明,危害辽宁北苍术生产的主要病害有3种,为苍术叶斑病、苍术炭疽病和苍术菌核病。苍术菌核病多发生于早春,病株率相对较低,约为4.8%～9.9%,但病株死亡率高,达90%以上。苍术叶斑病和炭疽病为辽宁省新发生病害,其中苍术叶斑病分布十分广泛且危害严重,各调查种植区均有分布,以清原地区发病较为严重,病株率约为15.1%～100.0%,病叶率为35.2%～91.8%。苍术炭疽病仅在抚顺、本溪和沈阳发生,抚顺地区发病相对较重,病株率约为25.0%～40.4%,病叶率约为14.9%～54.1%。

苍术; 病害调查; 种类鉴定; 叶斑病; 炭疽病; 菌核病

苍术为菊科多年生药用植物,主要分布于我国华北、西北和东北等地区[1],以茅苍术[Atractylodeslancea(Thunb) DC.]和北苍术[A.chinensis(DC.) Koid Z.]干燥的根茎入药,具有健脾、燥湿、明目等功效[2-3],有较高的药用价值和经济价值。随着野生北苍术的开发与利用,资源逐渐减少,难以满足市场需求,为保护野生资源及自然生态环境平衡发展,近年来辽宁省抚顺、本溪等地大面积规模化人工栽培。随着野生北苍术的家植驯化,以及栽培面积的增大,病害问题日渐突出,已成为制约苍术种植业发展的主要问题。

药用植物栽培地域和生境以及环境条件和栽培品种差异直接影响病害发生种类及危害情况[4-5]。湖北和南京等地茅苍术生产中常见病害有由Sclerotiniarolfsii引起的白绢病、由Alternariatenuissima引起的黑斑病和由Ascochytasp.引起的轮纹病等[6-8],其中黑斑病发生极为严重,各年生苍术上均有发生,一般田块减产约15%,发病严重的田块产量损失高达70%以上[9]。辽宁东部山区近年来大面积人工种植北苍术,仅抚顺地区已超过133 hm2,并有继续扩大种植的趋势。辽宁北苍术病害种类和发生危害明显区别于其他苍术种植区,作者在2012年报道了辽宁省清原县苍术种植区由Sclerotinianivalis引起的菌核病的发生危害[1],查阅国内外文献尚未见辽宁省北苍术的其他病害的研究报道。为明确辽宁省北苍术生产中病害发生种类和危害情况,2011年始对辽宁省抚顺、清原和新宾等7个县(市)北苍术种植区进行系统调查,并对其病害症状和病原形态进行了详细描述,旨在为辽宁北苍术病害的田间识别和病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及病样采集

2011年5月—2015年10月对辽宁省抚顺、清原和新宾等7个主要北苍术(A.chinensis)种植区(表1)进行病害调查。采用五点取样法[10],每点随机调查100株,每块地重复3次,统计病害种类以及每种病害的危害部位、症状和危害程度,并拍照记录；调查每种病害的病株数和病叶数,分别计算病株率和病叶率[11]。在田间采集具有典型症状的苍术带回实验室,进行分离、鉴定。

病株率(%)=发病株数/调查总株数×100;

病叶率(%)=发病叶片数/调查总叶片数×100。

1.2 病原菌分离与鉴定

采用常规组织分离法进行病原菌分离,于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上纯化培养后置于4℃冰箱保存备用。利用光学显微镜观察病原菌形态特征,结合形态学和分子鉴定,参照相关文献明确其病害种类[12-16]。

1.3 致病性测定

根据柯赫氏法则,在实验室内进行回接北苍术试验。取健康的2年生北苍术叶片,用75%乙醇表面消毒后置于铺有保湿滤纸片的保鲜盒内培养。苍术叶斑病和炭疽病采用菌悬液喷雾接种[17],孢子悬浮液浓度为106个/mL,分别喷雾接种到5个北苍术叶片上,以喷无菌水作对照。苍术菌核病采用菌丝块接种2年生北苍术根[1]。接种后喷雾保湿并封闭保鲜盒,置于28℃条件下诱导发病,每天观察并记录发病情况。试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 北苍术病害种类及危害情况

调查结果表明,近年来辽宁省北苍术主要病害有3种,分别为苍术菌核病、苍术叶斑病和苍术炭疽病。苍术菌核病多发生于早春,一般在4月中上旬开始发病,4月下旬至5月为发病盛期。该病主要分布在清原、抚顺、本溪、沈阳等地,病株率较低,其中清原地区发病相对重,病株率约为4.8%～9.9%,其他地区零星发生,发病率均低于5%,但病株死亡率高,均达90%以上。苍术叶斑病和炭疽病为辽宁省新发生病害,其中苍术叶斑病分布十分广泛且危害严重,各调查种植区均有分布,以清原地区发病较为严重,病株率约为15.1%～100.0%,病叶率约为35.2%～91.8%。该病在6月中下旬至10月份均有发生,8月中上旬至9月上旬为发病盛期。苍术炭疽病仅在抚顺、本溪和沈阳发生,抚顺地区发病相对较重,病株率约为25.0%～40.4%,病叶率约为14.9%～54.1%,本溪和沈阳地区该病发生程度相对较轻,病株率低于25%,其他县(市)均未见发生(表1)。该病6月下旬开始发病,8月下旬为盛发期,具有明显发病中心,一旦病害发生,蔓延极快,常致叶片成点状成批枯死。

表1 2011-2015年辽宁省不同地区北苍术病害发生程度调查1)

1) “-”表示未发现该病害。

“-” means no diseases observed.

2.2 辽宁省北苍术病害症状及病原

2.2.1 苍术菌核病

苍术菌核病主要危害根及根茎部,也可危害茎基部。发病初期,根部和茎基部出现褐色至黑褐色腐烂,病健交界不明显,皮层腐烂易露出里层纤维组织,受害植株地上部分底层叶片先开始变黄、枯萎,逐渐向上蔓延,湿度大时病株根茎及附近土表出现白色棉絮状菌丝,后期形成卵圆形或不规则形、直径0.8～6.9 mm的黑色菌核,严重时甚至全株枯死(图1a～b)。田间未发现子囊盘形成。

病菌在PDA上形成圆形菌落,气生菌丝发达,绒毛状,初期白色,后期呈肉桂色。7 d后培养皿边缘气生菌丝较浓厚处首先集结形成突起,初期较小、乳白色,随后突起逐渐膨大,颜色加深,形成球形或近球形、直径约0.5～4.5 mm黑色菌核,菌核之间有白色菌丝分布。部分菌核延长或融合成不规则形,并紧贴于培养基表面(图1c～d)。菌丝直角分支,有隔(图1e),通过该病的田间危害症状、病原的形态特征及ITS鉴定,可确定病原菌为雪腐核盘菌(Sclerotinianivalis)[1, 12]。

2.2.2 苍术叶斑病

苍术叶斑病主要危害叶片,底层老熟叶片发病重,也可危害茎部。受害植株叶片形成中央白色、边缘黑褐色的圆形或不规则形病斑,随后病斑扩大、汇合,湿度大时产生黑色分生孢子器,埋生或半埋生于叶片表皮层。田间发病多分散,存在多个病害中心,降雨后病害程度明显加重(图2a～b)。

病菌在PDA上菌落近圆形,边缘不规整,中央深褐色,外缘灰白色(图2c)。分生孢子器大小(79.8～253.4)μm×(65.3～140.1)μm,含4～6层拟薄壁组织,外壁黑色,有孔口,呈瓶形或安瓿形(图2d)。产孢细胞安瓿形或瓮形,直径2.5～3.0 μm。分生孢子透明、单胞,椭圆形或短棒状,大小(6.5～9.1)μm×(1.8～3.0)μm(图2e)。

对病原菌的ITS(引物ITS1/ITS4)和LSU(引物LR0R/LR7)序列进行PCR扩增[14]和测序,分别获得长度为549 bp和1 051 bp的DNA序列。测序结果在GenBank中进行BLAST比对,结果显示,该病菌(GenBank登录号分别为KP690076和KP690077)与菊异茎点霉(Paraphomachrysanthemicolastrain CBS 522.66)的同源性高达98%。利用Mega 6.0 构建不同异茎点霉的联合系统发育树(图3),显示该病菌与Paraphomachrysanthemicola(strain CBS 522.66和CBS 172.70)聚在一支。致病性测定结果表明,接种后4～5 d开始发病,7 d后病斑大小为0.4～1.0 mm,对照未发病。结合该病的田间危害症状、病原的形态特征、培养性状、致病性测定及多基因(ITS和LSU)鉴定,可确定病原菌为菊异茎点霉(Paraphomachrysanthemicola)[15]。

图2 苍术叶斑病症状和病原形态特征Fig.2 Symptom and pathogen characteristics of leaf spot on Atractylodes chinensis

图3 基于ITS和LSU基因片段利用邻接法(NJ)构建的苍术叶斑病菌与近似菌株的系统发育树Fig.3 Neighbor-joining tree (NJ) derived from sequences of the rDNA-ITS and LSU fragments of the Paraphoma chrysanthemicola on Atractylodes chinensis and other species

2.2.3 苍术炭疽病

苍术炭疽病主要危害叶片,也可危害花萼。初期形成褐色、圆形或不规则形小斑,病健分界明显,随后病斑扩展、合并、深棕色、略凹,成熟病斑表面出现散生或轮纹状排列的小黑点,即分生孢子盘。高湿条件下,病斑上出现大量红色黏质团,即分生孢子团。发病后期叶片变黄、枯萎、脱落,严重时,顶部嫩叶和花萼也可染病(图4a)。

病菌分生孢子盘盘状、聚生,黑色或黑褐色;刚毛深褐色,顶端较尖,1～3个隔膜;分生孢子梗圆柱形,无色单胞,顶端略尖,大小为(8.9～28.3)μm×(2.5～3.9)μm(图4c)。分生孢子圆柱形、无隔、光滑,含1～2个油球,大小(13.5～18.6)μm×(3.9～6.6)μm(图4d)。附着胞单胞,灰褐色,椭圆形或不规则形,大小(7.5～13.1)μm×(6.5～10.4)μm(图4e)。PDA上菌落白色至橘黄色,后期产生灰色或橘黄色棉絮状菌丝,皿背轮纹状,25℃菌落平均生长速度为3.2 mm/d(图4b)。

对病原菌的ITS(引物ITS1/ITS4)、GAPDH(引物GDF1/GDR1)、CHS-1(引物CHS-354R/CHS-79F)、ACT(引物ACT-512F/ACT-783R)和TUB(引物T1/BT4R)序列进行PCR扩增[16]和测序,分别获得长度为558、196、255、237 bp和439 bp的DNA序列,GenBank登录号分别为KR149280、KR259334、KR259333、KR132243和KU058178。利用Mega 6.0 分别构建单基因和多基因联合系统发育树(图5),显示该病菌聚在Colletotrichumdestructivum复合群[16],与C.destructivum,C.higginsianum、C.lini和C.tanaceti关系较近,但独立分成一支。致病性测定结果表明,接种后3～5 d开始发病,7 d后病斑大小为0.2～0.8 mm,对照未发病。结合该病的田间危害症状、病原的形态特征、培养性状、致病性测定及多基因系统发育分析,初步鉴定该菌为炭疽菌(Colletotrichumsp.)[16,18]。

图4 苍术炭疽病症状和病原形态特征Fig.4 Symptom and pathogen characteristics of anthracnose on Atractylodes chinensis

图5 基于rDNA-ITS、GAPDH、CHS-1、ACT和TUB基因片段利用最大似然法(ML)构建的苍术炭疽病菌与近似菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree derived from sequences of the rDNA-ITS, GAPDH, CHS-1, ACT and TUB fragments of Colletotrichum sp. on Atractylodes chinensis and other Colletotrichum species by maximum likelihood (ML)

3 讨论

环境条件和栽培品种不同导致地域间病害种类及其发生情况有明显差异[19]。本文对辽宁省主要北苍术种植区进行系统调查,结果表明,危害辽宁北苍术生产的主要病害有3种,为苍术菌核病、苍术叶斑病和苍术炭疽病,与已报道的湖北等地茅苍术的结果差异较大。辽宁省北苍术主要在温带大陆性气候的辽东山区种植,而湖北等南方地区多为亚热带地区,雨量相对更充沛,田间湿度更大,温度更高[20-21],更适宜黑斑病和白绢病等喜高温病菌[9]的发展和蔓延,而这些病害在辽东山区不适于发生和蔓延,因此在调查中未发现白绢病和黑斑病的发生危害。本研究表明,北苍术叶斑病的致病菌为Paraphomachrysanthemicola,与江苏和湖北等地的茅苍术内分离到的P.chrysanthemicola同种,但对茅苍术无致病力,为茅苍术内生菌[22]。同时,在苍术叶斑病菌分离过程中,作者亦分离到大量链格孢菌(Alternariasp.),但致病性测定表明均无致病力,认为是腐生菌,且苍术叶斑病的田间症状与已报道的黑斑病田间症状差异明显,苍术黑斑病病斑黑褐色,湿度大时病斑两面产生黑色霉层[8],而苍术叶斑病病斑中央白色、边缘黑褐色,湿度大时产生埋生或半埋生的分生孢子器。

菌核病多发生在早春,降水量、土壤湿度、低温冻害以及伤口是影响病害发生的主要因素[1, 23-24]。辽宁北苍术菌核病一般在4月中上旬开始发病,4月下旬至5月为发病盛期,因辽东山区降雨量大,土壤湿度高,早春昼夜温差大,反复冻融现象常见,造成苍术根茎部伤口多、冻伤面积大,利于苍术菌核病的发生和扩展蔓延。国内外学者认为,S.nivalis不易形成子囊盘,其在病组织上以菌丝体或形成菌核越冬,翌年菌丝或菌核萌发直接产生的菌丝侵染寄主,引发菌核病[25],作者连续5年田间调查自然条件下均未见子囊盘的形成,但生产中菌核病危害严重,这也证明了该病菌以菌丝或菌核直接萌发侵染,病菌以菌丝或菌核在土壤和病组织中越冬[26]。由于药用植物种苗调运频繁,建议选用无病区种苗,移栽前进行种苗消毒,栽培中覆膜覆草等措施进行防冻,降低病害发生率[27]。

辽宁已成为我国主要的苍术种植区之一,随着栽培面积增大,种植年限增加,田间各种菌源积累量增多,加之栽培区环境条件适宜,病害问题现已成为辽宁北苍术产业健康可持续发展的限制性因素之一。苍术菌核病、叶斑病和炭疽病均为辽宁北苍术生产中近年来新发生流行病害,研究历史短,研究基础较为薄弱,有效防控措施单一,病害侵染特性、流行动态及致病机制等方面尚需要进一步深入研究,以满足生产中病害防控的需求,保障辽宁北苍术产业的健康发展。

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(责任编辑:杨明丽)

The survey and identification of disease on Atractylodes chinensis in Liaoning Province

Xu Haijiao, Ge Xinxin, Zhou Rujun, Fu Junfan, Zhao Jiefeng

(Plant Protection College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Atractylodeschinensisis a traditional Chinese medicinal plant, which is highly valued as economic and medicinal crop. In recent years, it has been planted widely in mountain regions of eastern Liaoning Province. In order to reduce the risk of diseases in the culturing of the plant, the major diseases and its occurrence ofA.chinensisin seven major producing regions, including Fushun, Qingyuan and Xinbin of Liaoning and other regions were investigated from 2011 to 2015. The results showed that there were three kinds of main diseases, viz. leaf spot, anthracnose and sclerotinia rot. Sclerotinia rot occurred in early spring with a relatively low disease incidence of 4.8% to 9.9%, but the mortality of infected plants was over 90%. Leaf spot and anthracnose ofA.chinensiswere newly found in Liaoning. Leaf spot occurred broadly and seriously, and distributed in all the surveyed regions, but occurred more seriously in Qingyuan, with the diseased plants incidence of 15.1% to 100.0%, and diseased leaves incidence of 35.2% to 91.8%. Anthracnose onA.chinensisoccurred only in Fushun, Benxi and Shenyang, and it occurred more seriously in Fushun, with the diseased plant incidence of 25.0% to 40.4%, and diseased leaves incidence of 14.9% to 54.1%.

Atractylodeschinensis; survey of disease; species identification; leaf spot; anthracnose; sclerotinia rot

2015-12-25

2016-02-02

S 435.672

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.026

* 通信作者 E-mail: zrj5823@163.com