青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究

罗亚婷, 许景升, 徐 进, 张 昊, 冯 洁

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)



研究报告

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究

罗亚婷, 许景升, 徐 进, 张 昊, 冯 洁*

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,控制细菌的毒性和蛋白泌出。本试验构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。与野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失导致了突变菌株运动能力显著增强,在接种前期突变株病情指数明显下降;通过qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,其中popA、popB和popP基因表达量上调,而popC表达水平下调。T6SS基因簇的缺失影响了Po82菌株的运动能力和Ⅲ型效应子基因的表达,使得Po82病程延长。这些结果说明,T6SS参与青枯菌的致病过程,且T6SS与T3SS之间有复杂的未知调控关系。

青枯菌; Ⅵ型分泌系统; 基因簇; 致病力

由青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的植物细菌性枯萎病是危害性巨大的植物细菌性病害之一。青枯菌寄主范围非常广,可危害马铃薯、烟草、番茄、香蕉、花生、茄子和姜等重要作物,造成严重的经济损失[1-2]。青枯菌通过非常复杂的多元件网络调控众多致病因子,如胞外蛋白酶,细胞壁降解酶,多糖和Ⅲ型分泌系统及其效应蛋白等[3],感知内部和外部环境的变化,增强其致病力和适应能力。

Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system,T6SS)广泛存在于致病性革兰氏阴性细菌中,包括霍乱弧菌(Vibrocholerae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonellaenterica)和鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)等,与病原菌的致病力、细菌竞争及互作等多种生命活动密切相关,其分泌的效应蛋白作用于原核和真核细胞。T6SS通常由一个平均长度超过20 kb的基因簇编码[4]。关于T6SS及其效应子的研究多集中在人类病原菌中,如,黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、霍乱弧菌(V.cholera)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。比较基因组分析和功能验证发现,动物病原菌中的T6SS在细菌毒性方面具有重要作用[5-7],而在其他细菌存在的情况下,动物病原菌中的T6SS通过刺激菌体增殖,抑制寄主免疫反应,从而增加自身对环境的竞争适应性[8]。目前研究人员也在根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、青枯菌(R.solanacearum)、丁香假单胞菌(P.syringae)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)和P.protegens等植物病原菌中开展T6SS的相关研究。在P.syringaepv.tomatoDC3000菌株中有3个T6SS,分别缺失T6SS-Ⅱ和T6SS-Ⅲ后均影响病原菌在烟草上的定殖以及对番茄的致病力[9]。

我们前期研究发现,青枯菌Po82菌株的4个核心基因vasF、hcp、vgrG和impA的缺失,可导致病菌致病力明显减弱,但致病性并未完全丧失,而Ⅵ型分泌系统重要组成基因tssM的突变不仅影响了病菌的致病力,而且影响了Ⅲ型分泌系统部分效应子的表达[10],表明Ⅵ型与Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)之间可能存在着某种未知的协同调控机制。单个基因的突变不足以反映T6SS的整体功能,因此我们决定整体缺失Po82菌株中T6SS基因簇,通过致病力和基础生物学测定,以期评价T6SS的作用和发掘T6SS与T3SS之间的调控关系,探究T6SS在青枯菌致病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和质粒

本研究所使用的菌株、质粒特征及来源见表1。青枯菌菌株Po82采用NA或NB培养基,28℃条件下培养。大肠杆菌(EscherichiacoliDH5α)采用LB培养基(固体或液体),37℃培养箱中培养。

表1 本试验所用菌株与质粒

1.2 主要试剂和仪器

2×GC buffer I、Ex Taq 酶、dNTP Mix (2.5 μmol/L)等购自大连宝生物(TaKaRa)公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、SYBR Green Master Mix (Low ROX Premixed)等购自诺唯赞(Vazyme)生物科技公司;其他试剂和仪器包括DNA ladder、琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)、质粒小提试剂盒(Axygen)、中美泰和无缝连接试剂盒;荧光定量PCR仪(ABI 7500),分光光度计(Analitik Jena)等。氨苄青霉素Amp(终浓度100 μg/mL),庆大霉素Gm(终浓度50 μg/mL),卡那霉素Kan(终浓度50 μg/mL)。

1.3 培养基

1%蔗糖NA培养基为NA培养基加1%(W/V)蔗糖,10%蔗糖NA培养基为NA培养基加10%(W/V)蔗糖;半固体培养基(SMM):葡萄糖100 mg,蛋白胨100 mg,乙二胺四乙酸二钠38 mg,pH=7.0的磷酸盐缓冲液10 mL,琼脂2.5 g,用蒸馏水定容到1 000 mL,121℃灭菌15 min;hrp诱导培养基[11]等。

1.4 试验方法

1.4.1 青枯菌Po82菌株T6SS基因簇缺失载体构建

本试验采用USER(uracil-specific excision reagent)技术一步构建自杀载体进行同源重组双交换,敲除目标基因[12-13]。参照Po82(全基因组序列GenBank登录号: CP002819),根据T6SS基因簇的上下游序列设计引物。其中左臂引物为821UF/UR,右臂引物为821DF/DR(表2)。以青枯菌菌株Po82基因组DNA为模板分别扩增T6SS基因簇的上下游,得到左臂片段2.5 kb,右臂片段2.8 kb。扩增条件为:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后备用;将基因左臂序列、右臂序列连接到酶切处理后的pKMS1-gm(+U)载体上,连接体系25 μL:USER酶(1 000 U/mL)1 μL,pKMS1-gm(+U)质粒4 μL,上游片段(+U)10 μL,下游片段(+U)10 μL;连接条件:37℃,20 min;25℃,20 min。

连接产物采用热击法转化E.coliDH5α:转化菌液涂于含50 μg/mL Gm 的LB平板上37℃培养过夜。挑单菌落于含50 μg/mL Gm的液体LB培养基中,37℃,180 r/min培养过夜,离心收集菌体提取质粒。将构建好的重组质粒(pKMS1-Ⅵ-gm)进行PCR验证后交由上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定。

植物青枯菌Po82菌株的自然转化[14-15]:挑取Po82菌株单菌落于hrp液体培养基中,28℃,180 r/min培养至A600=0.8～1.0,取50 μL菌液于1.5 mL离心管中后加入2～5 μg 重组自杀质粒后混匀备用,将灭菌后的0.45 μm的滤膜放在hrp固体培养基中,约3～5个/皿。将菌液点在滤膜上,不倒置,28℃培养48 h。

基因突变菌株的筛选和鉴定:(1)自然转化培养48 h后,用无菌水洗脱滤膜上的菌脓并涂布于含Gm 的NA平板上,28℃培养24～48 h,从中挑取单菌落,用含Gm 的1%蔗糖NA液体培养基摇菌3～4次后,用植物青枯菌特异性引物759/760鉴定筛选的菌株为青枯菌;(2)将上一步得到的菌液稀释到10-6后,取200 μL涂布于含Gm 的10%蔗糖NA固体平板上,于28℃培养24～48 h。将长出的单菌落挑出,用含Gm 的10%蔗糖NA液体培养基摇菌;(3)用T6SS基因簇核心基因引物(表2)进行目的基因扩增鉴定,根据扩增情况判断是否发生双交换,最后得到突变菌株Po82ΔVI。

1.4.2 基因互补菌株的构建

根据基因序列,以青枯菌Po82基因组DNA为模板,设计T6SS基因簇3个核心基因vgrG1、vgrG2、hcp引物对:VgrG1OF/R、VgrG2OF/R和HCPOF/R,引物对含上游约600 bp区域,可能包含其启动子(表2)。PCR扩增条件为:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,共35个循环;72℃延伸10 min。质粒pBBR1MCS-4是广寄主克隆载体,在细菌体内表达能力较弱,故加入一段强启动子序列得到重组质粒pBBR1MCS-4_PSA,作为互补质粒。设计引物对pBR4PSAF/R(表2),PCR扩增条件为:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃4 min,共35个循环;72℃延伸10 min。所得PCR产物(vgrG1为1 238 bp,vgrG2为1 232 bp,hcp为1 143 bp)经琼脂糖凝胶电泳回收纯化,连接到质粒pBBR1MCS-4_PSA上。连接体系为10 μL:2×Master Assembly Mix 5 μL,pBBR1MCS-4_PSA (64 μg/mL)1 μL,片段2 μL,ddH2O 2 μL。50℃连接15 min,采用热击法转化E.coliDH5α。

在含Amp的LB平板上挑取单菌落于含Amp的液体LB中振荡培养后提取质粒。将构建好的重组质粒(pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2、pBR4PSA-hcp)进行PCR验证后交由上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定后用于互补试验。

制备青枯菌Po82菌株电击感受态:参照Lavie等[16]的方法,将构建好的重组表达载体pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2、pBR4PSA-hcp分别电击导入青枯菌Po82ΔⅥ菌株中,在含有Gm和Amp的平板上筛选后进行PCR检验和测序验证,最终获得具有抗性的互补菌株Po82ΔⅥ-vgrG1、Po82ΔⅥ-vgrG2和Po82ΔⅥ-hcp。

表2 所用引物序列

续表2 Table 2(Continued)

引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)(下画线部分为接头)Primersequences(Theunderlinedpartisthejoint)靶标基因Targetgene退火温度/℃Annealingtemperature延伸时间ExtensiontimepBR4PSAFpBR4PSARATCGTCGAACGGCAGCGATAAAGCTTGCTGCAGGTCGAATGTCTGGAAGATCCTCGAGAGCTCCGATGATAAGCTGpBR4PSA604min82tssLF82tssLRCCGGCGAAACGTTCTTCATCGAATAGCCCTCCAGCGTCTCtssL6030sDUF876FDUF876RAGAAGTCGGTGAAGCTGGTGGAAGTAGCGCGTCGAGATCADUF8766030sDUF877FDUF877RCGAGTACGCCAAGTGGAAGTCACCGGTTGAGGAAGGTCTCDUF8776030s82HcpF82HcpRTGAAGGATATCTACGTCAAGTTCGAACCGAGTAGGTCTTGTCGTTChcp6030s82vasAF82vasARAAGCGGTCGGCTTTACAGAAACCACGGACAGATGGTTGAGvasA6045s82vgrGF82vgrGRGCTCGATTTGCTGACCCAACGTACTGGCCGGGGTAATCGvgrG6030s82impAF82impARTGACCGAGATCAAGGAAGCGCCCAACCCCAACAGTTCCTCimpA601mingyrBFgyrBRGACCTTCCAGGGGTTGATCGTCTCCCCCAGCCCCTTATACgyrB5830spopAFpopARTTCAGGAGCTTCACCAGGTCTCAACACCAATGGCAACTCCAApopA5830spopBFpopBRTGTTCATCAGCGCATCCTCCCCGATACAGGCGGCGATACpopB5830spopCFpopCRGCTTGTGCTTGTGCTTGTGCTTTGCTGCGGAATCAGCTTGCGGTGpopC5830spopPFpopPRCTCGGTATAGCCCGGCAAATCAAAGGATGCGTTTGTGGCApopP5830s

1.4.3 野生型、突变菌株以及互补菌株致病力测定

采用伤根浇注菌液接种法[17],接种番茄感病品种‘中杂9号’,每株番茄苗浇注30 mL浓度为3×107cfu/mL的菌悬液,野生型、突变株及互补菌株各接种20株,接种试验各重复3次。培养条件:光照培养箱,L∥D=16 h∥8 h光周期,28～30℃,相对湿度90%。调查方法:青枯病的病情调查参照Meng等[18]的方法。每天调查发病情况,持续观察2～3周,记录病情指数并进行方差分析。

1.4.4 野生型、突变菌株以及互补菌株生长曲线的测定

分别挑取植物青枯菌Po82菌株、基因簇缺失突变株和互补菌株的单菌落,接于含10 mL NB培养基的三角瓶中,28℃振荡培养过夜。取过夜培养菌液稀释至A600=0.1,然后按1∶100的体积比分别接种于100 mL NB液体培养基内。28℃,180 r/min振荡培养。从振荡培养开始,每隔3 h,取样检测培养基中的菌体浓度(A600),以不含菌液的NB培养基为空白对照,当所测样品的浓度A600>1.0时,对样品进行梯度稀释,使每个稀释后样品的A600<1.0,再根据稀释倍数计算出原始菌液的A600值,试验重复3次,进行统计分析。

1.4.5 野生型、突变菌株以及互补菌株运动性的测定

采用针刺接种法进行运动性测定,用接种针粘取单菌落,穿刺到含0.25%琼脂的SMM平板上,不接触平板底部。培养皿不倒置,30℃静置培养7～9 d[19-22]。运动性细菌向周围爬行后会形成一个明显的圆形斑,观察并测量平板上的菌落直径并进行统计学分析。

1.4.6 野生型、突变菌株以及互补菌株生物膜的测定

生物被膜的测定方法参照Zhang等[10,23]。挑取NA固体培养基平板上的青枯菌Po82菌株、突变株和互补菌株的单菌落至NB液体培养基中,培养至A490=0.7～0.8;用新鲜的L液体培养基按比例1∶100 稀释至60 mL三角瓶中;30℃静置培养7 d,每个处理重复3次;加入600 μL 0.1%(W/V)结晶紫溶液染色30 min;用洗瓶尽量小心地冲洗,避免将生物被膜破坏,反复冲洗3～5次;加入95%乙醇1 mL进行洗脱,采用分光光度计测量洗脱液的吸光度值(A490)。

1.4.7 qRT-PCR检测T3SS相关基因的表达

本试验选取持家基因gyrB作为内参基因,T3SS相关基因popA、popB、popC、popP进行qRT-PCR检测。设计引物(表2),扩增产物长度约150～200 bp。通过PCR扩增检验引物特异性和扩增效率,扩增条件:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃30 s,共35个循环;72℃延伸10 min。

三是大力发展民生水利，着力提高水利公共服务能力。完成17处大型灌区和9处中型灌区年度节水改造任务，实施好6个规模化节水灌溉增效示范项目建设，建设节水灌溉面积510万亩（34万hm2）、“旱能浇、涝能排”高标准农田385万亩（25.67万hm2）。解决360万人饮水安全问题，推进沿黄地区饮水安全平原水库建设，建立县级水质检测中心和供水服务“116”热线。

通过TRIzol法提取青枯菌野生型和突变菌株的RNA,具体步骤参考张丽勍等[17]。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度。采用反转录试剂盒HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)得到cDNA后,进行qRT-PCR。相关基因表达情况的分析采用相对定量的方法(2-△△Ct)[24]。

反应体系 20 μL:SYBR Green Master Mix 10 μL,cDNA 2.0 μL,Primer F/R(10 μmol/L)0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反应程序:95℃ 10 min;95℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,共40个循环;95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 30 s,60℃ 15 s。

2 结果与分析

2.1 青枯菌Po82菌株T6SS基因簇突变株的构建与鉴定

通过培养基筛选得到具有Gm抗性和对蔗糖敏感的突变株后,进行PCR验证,选用T6SS基因簇7个核心基因引物进行验证(图1),同时将PCR产物纯化后送上海生工公司测序,通过序列比对后,得到性状稳定的突变菌株Po82ΔⅥ。

图1 T6SS突变菌株Po82ΔⅥ的PCR检测结果Fig.1 PCR analysis of T6SS gene cluster of the mutant strains

2.2 互补菌株的构建与鉴定

hcp和vgrG不仅是T6SS装置的结构组分,也是T6SS分泌出的效应子蛋白,作为功能性T6SS的标志基因,存在于所有的T6SS中。本研究选取hcp、vgrG1和vgrG2作为T6SS基因簇缺失突变株的互补基因。根据Po82基因组中hcp、vgrG1和vgrG2核苷酸序列设计引物,PCR扩增得到3个基因片段并连接至互补载体pBBR1MCS-4_PSA中,经PCR和测序验证,载体pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2和pBR4PSA-hcp构建成功。随后,将重组载体分别电转化转至突变株Po82ΔⅥ中,于含有Gm和Amp抗性的NA平板上筛选转化子。PCR检验和测序验证,最后获得互补菌株,分别命名为Po82△Ⅵ-vgrG1、Po82△Ⅵ-vgrG2和Po82△Ⅵ-hcp(图2)。

图2 T6SS基因簇3个核心基因互补菌株Po82ΔⅥ-vgrG1、Po82ΔⅥ-vgrG2和Po82ΔⅥ-hcp的鉴定Fig.2 PCR analysis of the three core gene complementary strains Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

伤根浇注菌液接种法接种番茄进行致病力测定,统计结果表明:Po82菌株在接种后第4天开始发病,突变株Po82ΔⅥ在接种后第5天才出现明显的萎蔫症状;在接种后的第10天,Po82野生型菌株的病情指数达到88.89,而突变株Po82ΔⅥ仅为59.52,下降了33.04%,两者差异极显著(P<0.01)(图3)。随着接种天数的增加,15 d后,互补菌株的病情指数与野生型菌株没有明显差异(P>0.05)。

图3 野生型菌株、T6SS基因簇突变株和互补菌株致病力测定结果Fig.3 Virulence test of the wild-type Po82, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.4 T6SS缺失对青枯菌生长能力的影响

试验结果显示,在NB培养基的培养条件下,突变株Po82ΔⅥ较野生型菌株在对数生长期的生长速率减慢,差异极显著(P<0.01)。随着培养时间的增加,突变菌株、互补菌株的生长速率与野生型菌株没有明显差异(P>0.05)(图4)。结果表明:T6SS基因簇影响青枯菌Po82菌株前期的生长速率。

图4 野生型菌株、T6SS基因簇突变株和互补菌株生长曲线测定结果Fig.4 Growth curve of the wild-type Po82, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.5 T6SS缺失对细菌运动性的影响

将各菌株接种至半固体培养基,菌落直径测量结果分析表明,突变株Po82ΔⅥ的运动能力增强,与野生型菌株Po82有极显著差异(P<0.01),互补hcp的菌株运动能力增强,有极显著差异(P<0.01);互补vgrG1的菌株运动能力减弱,没有明显差异;互补vgrG2基因的菌株运动能力明显减弱,有极显著差异(P<0.01)(图5)。结果表明:T6SS基因簇影响青枯菌Po82菌株运动能力,并且T6SS基因簇内不同基因对青枯菌的运动性具有不同的作用。

图5 野生型菌株、突变菌株及互补菌株的运动性试验Fig.5 The mobility of the wild-type Po82 strain, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.6 T6SS缺失对细菌生物膜形成的影响

采用结晶紫法对青枯菌株Po82野生菌株、突变株及互补菌株进行了测定。研究表明,突变菌株Po82ΔⅥ形成生物被膜的能力较野生型弱,但差异不显著(P>0.05)。互补菌株与野生型菌株形成生物被膜的能力没有明显差异(P>0.05)(图6)。结果表明,青枯菌T6SS不影响青枯菌生物膜的形成。

图6 野生型菌株,突变菌株及互补菌株的生物被膜形成结果Fig.6 Biofilm formation of the wild-type Po82 strain,Po82ΔⅥ, Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.7 T6SS缺失对青枯菌T3SS分泌蛋白基因表达的影响

T3SS在青枯菌致病过程中具有非常重要的作用,T3SS分泌的效应子多与致病性相关,而前期研究发现Ⅵ型分泌系统与Ⅲ型分泌系统之间存在着某种竞争关系[17]。T3SS标志效应子popA、popB、popC和popP的qPCR分析结果表明,突变株Po82ΔⅥ中popC表达量下调,popA、popB和popP表达量上调(图7);因此青枯菌中T6SS基因簇对T3SS效应子蛋白表达的影响涉及复杂的调控机制。

图7 qPCR检测Ⅲ型分泌系统效应子基因表达Fig.7 qPCR analysis of T3SS effector gene expression

3 结论与讨论

本实验室前期研究发现,将T6SS保守的核心基因tssM突变后,青枯菌致病力明显降低;qRT-PCR结果表明,突变株的Ⅲ型分泌系统部分效应子的表达显著上调,推测T6SS可能与T3SS存在着某种未知的竞争调控机制[10]。在铜绿假单胞菌中,T6SS和T3SS通过RetS/GacS和c-di-GMP途径来协同调控病原菌的生存方式及其感染策略[25]。采用生物信息学方法搜索青枯菌全基因组序列时,并未发现与铜绿假单胞菌中retS或gacS同源的基因或者蛋白,仅发现二鸟苷酸环化酶WspR同源蛋白,表明在植物青枯菌中T6SS影响T3SS效应子的机制不同于铜绿假单胞菌。T6SS通常由一个单一的包含15～20个保守开放阅读框的基因簇编码,基因簇中单个组成基因的突变不能从全局水平分析T6SS的作用,因此我们采取整体缺失T6SS基因簇的方法鉴定T6SS的功能。本研究发现青枯菌中T6SS对不同的Ⅲ型效应子蛋白的表达具有不同的影响,在选取的4个T3SS效应子蛋白中,与野生型菌株相比,其中3个(popA,popB和popP)在T6SS基因簇缺失突变体中表达量上调,这与单个T6SS基因(tssM)突变后的试验结果一致,但是popC表达量则下调,表明青枯菌通过复杂的调控机制和网络控制Ⅲ型效应子蛋白的表达和泌出,究竟T6SS采用何种方式影响T3SS效应子蛋白的表达还需要开展更为深入的研究,以解析这种影响机制。

Hcp和VgrG不仅是T6SS泌出蛋白,也是T6SS结构组成因子。细胞外组件Hcp(溶血素共调节蛋白)和VgrG(缬氨酸-甘氨酸重复蛋白G)形成类似细菌噬菌体尾部针状的注射装置,Hcp蛋白类似于λgpV尾管蛋白,形成一个六聚管状结构[26-27]。VgrG三聚体位于Hcp管的远端,形成一个类细胞穿刺装置的尾钉,VgrG在结构上类似于T4噬菌体中gp5-gp27融合蛋白[28]。因此选取T6SS核心组件基因hcp、vgrG1和vgrG2获得T6SS基因簇缺失菌株的互补菌株。

本试验通过构建T6SS缺失突变株和3个互补菌株,检测了T6SS对青枯菌致病力的影响。发现突变株对番茄的致病力在接种早期明显减弱,随着接种时间的延长,其致病力逐渐达到野生菌株的水平,而单基因的互补菌株致病力并没有完全恢复到野生型状态,尽管Hcp和VgrG是T6SS具有功能性的标志,但是单基因不具有T6SS基因簇的完整功能,后期还需要通过基因组文库进行完整的T6SS基因簇互补分析。

随后对T6SS基因簇进行了运动性和生物膜方面的试验,发现T6SS基因簇影响青枯菌Po82菌株运动能力,并且T6SS基因簇内不同基因对青枯菌的运动性具有不同的作用。Shalom等[29]的结果表明,hcp基因可能与运动性相关,本研究中也得到了相似的结果,hcp基因互补菌株的运动性能力显著增强。

此外,Po82菌株在青枯菌新的分类系统中属于演化型2,序列变种4,进化地位十分特殊[30-31]。本试验也为探究T6SS在青枯菌进化中是否发挥作用奠定了基础。

[1] Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, et al. Genome sequence of the plant pathogenRalstoniasolanacearum[J]. Nature, 2002, 415(6871): 497-502.

[2] Genin S, Boucher C.Lessons learned from the genome analysis ofRalstoniasolanacearum[J]. Annual Review of Phytopathology, 2004, 42: 107-134.

[3] 蔡刘体, 刘艳霞, 石俊雄. 青枯菌致病力的主要决定因子研究进展[J]. 贵州农业科学, 2015, 43(8): 109-113.

[4] 姚丰华, 张钰, 朱国强. 细菌Ⅵ型分泌系统结构与调控的研究进展[J]. 中国动物传染病学报, 2013, 21(6): 80-86.

[5] Silverman J M, Brunet R, Cascales E, et al. Structure and regulation of the type Ⅵ secretion system [J]. Annual Review of Microbiology, 2012, 66: 453-472.

[6] Blondel C J, Jimenez J C, Contreras I, et al. Comparative genomic analysis uncovers 3 novel loci encoding type six secretion systems differentially distributed inSalmonellaserotypes[J]. BMC Genomics, 2009, 10: 354.

[7] Boyer F, Fichant G, Berthod J, et al.Dissecting the bacterial type Ⅵ secretion system by a genome wideinsilicoanalysis: what can be learned from available microbial genomic resources[J]. BMC Genomics, 2009, 10: 104.

[8] Russell A B, Singh P, Brittnacher M, et al. A widespread bacterial type Ⅵ secretion effector superfamily identified using a heuristic approach [J]. Cell Host & Microbe, 2012, 11(5): 538-549.

[9] Wang Xiao’e, Basnayake B M V S, Zhang Huijuan, et al. TheArabidopsisATAF1, a NAC transcription factor, is a negative regulator of defense responses against necrotrophic fungal and bacterial pathogens [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2009, 22(10): 1227-1238.

[10]Zhang Liqing, Xu Jingsheng, Xu Jin, et al. TssM is essential for virulence and required for type Ⅵ secretion inRalstoniasolanacearum[J]. Journal of Plant Disease and Protection, 2012, 119(4): 125-134.

[11]Cunnac S, Boucher C, Genin S.Characterization of thecis-acting regulatory element controllinghrpB-mediated activation of the type Ⅲ secretion system and effector genes inRalstoniasolanacearum[J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(8): 2309-2318.

[12]Schäfer A, Tauch A, Jäger W, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from theEscherichiacoliplasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacteriumglutamicum[J]. Gene, 1994, 145: 69-73.

[13]Frandsen R J N, Andersson J A, Kristensen M B,et al. Efficient four fragment cloning for the construction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi [J]. BMC Molecular Biology, 2008, 9: 70.

[14]Le T, Leccas D, Boucher C.Transformation ofPseudomonassolanacearumstrain K60 [C]∥Angers: INRA.Proceedings of the 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, 1978: 819-822.

[15]Boucher C A, Barberis P A, Trigalet A P, et al. Transposon mutagenesis ofPseudomonassolanacearumisolation of Tn5-induced avirulent mutants [J]. Journal of General Microbiology, 1985, 131(9): 2449-2457.

[16]Lavie M, Shillington E, Eguiluz C, et al. PopP1, a new member of the YopJ/AvrRxv family of type Ⅲ effector or proteins, acts as a host specificity factor and modulates aggressiveness ofRalstoniasolanacearum[J]. Molecular Plant Microbe Interactions, 2002, 15(10): 1058-1068.

[17]张丽勍. 植物青枯菌GMI1 000菌株Ⅵ型分泌系统基因功能的研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2013.

[18]Meng Fanghong, Yao Jian, Allen C.A MotN mutant ofRalstoniasolanacearumis hypermotile and has reduced virulence[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193(10): 2477-2486.

[19]Adler J. Chemotaxis in bacteria[J]. Science, 1966, 153(3737): 708-716.

[20]Adler J, Templeton B.The effect of environmental conditions on the motility ofEscherichiacoli[J]. Journal of General Microbiology, 1967, 46(2): 175-184.

[21]Kelman A, Hruschk J. The role of motility and aerotaxis in the selective increase of avirulent bacteria in still broth cultures ofPseudomonassolanacearum[J]. Journal of General Microbiology, 1973, 76(1): 177-188.

[22]Yao Jian, Allen C.The plant pathogenRalstoniasolanacearumneeds aerotaxis for normal biofilm formation and interactions with its tomato host[J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(17): 6415-6424.

[23]Zhang Liqing, Xu Jingsheng, Xu Jin, et al. TssB is essential for virulence and required for typeⅥ secretion inRalstoniasolanacearum[J]. Microbial Pathogenesis, 2014, 74: 1-7.

[24]杨凤环. 水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号相关基因的功能鉴定及其毒性调控机理[D]. 北京: 中国农业科学院, 2012.

[25]Basler M, Pilhofer M, Henderson G P, et al. TypeⅥ secretion requires a dynamic contractile phage tail-like structure [J]. Nature, 2012, 483(7388): 182-186.

[26]Ballister E R, Lai A H, Zuckermann R N, et al.Invitroself-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America, 2008, 105(10): 3733-3738.

[27]Pell L G, Kanelis V, Donaldson L W, et al. The phage lambda major tail protein structure reveals a common evolution for long-tailed phages and the typeⅥ bacterial secretion system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America, 2009, 106(11): 4160-4165.

[28]Leiman P G, Basler M, Ramagopal U A, et al. Type Ⅵ secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America, 2009, 106(11): 4154-4159.

[29]Shalom G, Shaw J G, Thomas M S.Invivoexpression technology identifies a typeⅥ secretion system locus inBurkholderiapseudomalleithat is induced upon invasion of macrophages[J]. Microbiology, 2007, 153: 2689-2699.

[30]潘哲超. 植物青枯菌遗传多样性及致病力分化研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2010.

[31]刘蕾, 徐进, 许景升, 等. 青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系统调控基因hrpB的功能研究[J]. 植物保护, 2012, 38(5): 9-15.

(责任编辑:田 喆)

Functional analysis of a T6SS cluster of Ralstonia solanacearum Po82

Luo Yating, Xu Jingsheng, Xu Jin, Zhang Hao, Feng Jie

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The type Ⅵ secretion system (T6SS) is a machinery recently discovered in Gram-negative bacteria for translocation of proteins and also required for full virulence. In this study, T6SS gene cluster-deleted mutants ofRalstoniasolanacearumstrain Po82 were constructed in order to evaluate global functions of the T6SS cluster. We showed that the mutant strains had significantly attenuated their virulence on tomato plants in early stage. The expression of type Ⅲ effector genes,popA,popBandpopP, but notpopC, was up-regulated revealed by real-time PCR.In addition, the motility of the mutants was increased. These results indicated that the T6SS gene cluster is involved in pathogenesis ofR.solanacearumand there are complex unknown regulatory mechanisms between T6SS and T3SS.

Ralstoniasolanacearum; type Ⅵ secretion system; gene cluster; virulence

Research Reports

2016-01-26

2016-02-29

国家自然科学基金(31371908)

S 432.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.005

* 通信作者 E-mail: jfeng@ippcaas.cn