抑肽酶对跟腱断裂白兔模型跟腱修复中转化生长因子-β2表达的影响

王 虎 白 杨 单 臣

(吉林省人民医院，吉林 长春 130021)



抑肽酶对跟腱断裂白兔模型跟腱修复中转化生长因子-β2表达的影响

王 虎 白 杨 单 臣

(吉林省人民医院，吉林 长春 130021)

目的 观察抑肽酶对白兔跟腱断裂修复的影响。方法 选用60只新西兰白兔，随机分为三组(正常对照组、模型损伤组、抑肽酶治疗组)，于造模后第3天及第1、2、3、4周采集标本，RT-PCR方法检测转化生长因子-β2(TGF-β2) mRNA表达，免疫组化染色观察TGF-β2蛋白表达。结果 抑肽酶组在3 d TGF-β2 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶组TGF-β2 mRNA表达低于模型组，但无统计学意义。在第2～3周时，抑肽酶组中表达量明显低于模型组(P<0.05)。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表达，术后第3天时抑肽酶治疗组表达量高于模型组，第1周抑肽酶组中表达量明接近模型。2～4 w时抑肽酶组中表达量明显减少且低于模型组。结论 抑肽酶可减轻炎症反应，早期可通过调控TGF-β2的表达量，促进跟腱断裂的修复。

抑肽酶；跟腱断裂；转化生长因子-β2

跟腱断裂在临床骨科治疗过程中主要以石膏固定及手术治疗为主，但均不能取得满意的临床效果，可能会再次出现跟腱断裂〔1，2〕。抑肽酶是非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过抑制激肽释放酶以及纤溶酶而达到止血的目的，广泛用于体外循环的心血管手术和多种疾病的治疗〔3〕。目前抑肽酶在骨科应用的报道较少。本研究拟观察抑肽酶对跟腱断裂的修复作用。

1 材料与方法

1.1 动物 新西兰白兔，雌雄兼用，体重(2.8±0.2)kg。吉林大学实验动物中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 跟腱断裂白兔模型的建立 白兔适应性喂养3 d后进行造模。造模前12 h开始禁食、不禁水，直至实验结束。将白兔固定于手术台上，实施跟腱局部麻醉后，用手术刀切断跟腱内侧1/2组织，使中央部分成“V”字缺损。跟腱周围被膜丝线连续缝合，丝线间断缝合皮肤。术后无菌纱布包扎伤口，并扎紧，防止脱落。每只兔肌肉注射青霉素(1次/d，40万U/次)，连续3 d。伤口不给予更换纱布，不给予夹板固定，给予笼外放养，自由活动。所有动物外科手术操作由同一实验人员完成。

1.2.2 动物分组及给药 取60只新西兰白兔，随机分为三组：正常对照组(不做任何处理)，抑肽酶组(制备模型缝合键周膜后，损伤部位周围注射抑肽酶10 000 kIU/ml，缝合皮肤)，模型组，在损伤部位注射等容量生理盐水。

1.2.3 RT-PCR方法检测TGF-β2 mRNA表达 于造模后第3天及第1、2、3、4周每组白兔耳缘静脉注射空气 20 ml处死动物，取下造模侧的跟腱组织后，称取组织研磨裂解进行总RNA提取，利用核酸定量仪检测样品浓度。采用RT-PCR法检测TGF-β2基因的表达。TGF-β2(191 bp)正义链：5′ccggaggtgatctccatcta3′；反义链：5′actgagccagagggtgttgt3′。βactin(350 bp)正义链：5′aggccaaccgcgagaagaI，gacc3′；反义链：5′aggccaaccgcgagaagatgacc3′设置条件：变性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s。配置1.5%的琼脂糖凝胶，吸取5 μl PCR产物点样，120 U，30 min电泳。利用凝胶成像仪观察结果并采集图片，使用Quantity One对图片进行灰度扫描分析。

1.2.4 免疫组化染色观察TGF-β2蛋白表达 于造模后第3天及第1、2、3、4周每组白兔耳缘静脉注射空气 20 ml处死动物，取下造模侧的跟腱组织后，将跟腱用10%福尔马林固定，经石蜡包埋后，纵切厚4 μm标本，进行免疫组织化学检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS14.0 软件行t检验。

2 结 果

全部实验动物皮肤切口在术后1 w内基本愈合，未发生伤口感染情况。

2.1 RT-PCR方法检测TGF-β2 mRNA表达 图1，图2可见，抑肽酶组在3 d TGF-β2 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶组TGF-β2 mRNA表达低于模型组，但无统计学意义。在第2～3周时，抑肽酶组中表达量明显低于模型组(P<0.05)。第4周时两组的TGF-β2的表达量接近于正常组。

1.正常组;2.模型组;3.抑肽酶组，下图同图1 白兔跟腱组织中TGF-2 mRNA表达

2.2 TGF-β2在抑肽酶对白兔跟腱断裂模型跟腱修复中的表达 TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表达，术后第3天时抑肽酶治疗组表达量高于模型组，第1周抑肽酶组中表达量明接近模型。2～4 w时抑肽酶组中表达量明显减少且低于模型组。见图3。

图2 白兔跟腱组织中β-actin mRNA表达

图3 TGF-β2在白兔跟腱组织中的免疫组化表达(DAB,×200)

3 讨 论

跟腱断裂早期修复过程中常常形成粘连导致肌腱愈合不佳。资料报道，产生粘连的主要原因是由于损伤早期，出现炎症反应，在炎性细胞的作用下，成纤维细胞过量增殖，在损伤周围出现大量胶原纤维〔1〕。TGF-β 是一个多功能的多肽家族，在调节细胞的增殖与分化、细胞外基质的形成、细胞的移动、黏附、机体的生长发育、创伤修复等方面均有着非常重要的作用〔2，3〕。TGF-β促进组织修复的保护性因子，对软骨细胞生长及细胞外基质合成具有重要的调节作用〔4〕。TGF-β2又被称为软骨因子β，它可以促进骨膜间充质细胞的增殖，使其分化为软骨细胞，还可以促进细胞外基质如胶原、透明质酸酶和蛋白聚糖的合成〔5〕。TGF-β作用于肌腱愈合的所有阶段，能刺激外源性细胞迁移、调节蛋白酶、纤维素连接作用和刺激胶原产生〔6〕。TGF-β2可在体外促进肌腱细胞胶原的生成〔7〕。Decker等〔8〕对损伤修复后的马屈肌腱中的TGF-β的内源性表达情况进行研究，发现TGF-β2作为表达水平最高的生长因子，在修复第5天出现高峰，在本实验中可见，TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表达，术后第3天时抑肽酶治疗组表达量高于模型组，第1周抑肽酶组中表达量明接近模型。2～4 w时抑肽酶组中表达量明显减少且低于模型组。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表达，术后第3天时抑肽酶治疗组表达量高于模型组，第1周抑肽酶组中表达量明接近模型。2～4 w时抑肽酶组中表达量明显减少且低于模型组。这种现象说明抑肽酶可以通过改变TGF-β2的提前表达加速跟腱组织的愈合，而在后期TGF-β2表达下降，是否抑肽酶此时通过抑制跟腱的外源性愈合机制而主要是依靠腱细胞自身的分化增殖的内源性愈合机制促进跟腱的愈合，还是抑肽酶通过调控其他细胞因子如骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)等促进跟腱后期的愈合值得进一步研究。

1 Khanna A，Friel M，Gougoulias N，etal.Prevention of adhesions in surgery of the flexor tendons of the hand：what is the evidence〔J〕.Br Med Bull，2009；90(1)：85-109.

2 Heino J，Ignotz RA，Hemler ME，etal.Regulation of cell adhesion receptors by transforming growth factor-beta.Concomitant regulation of integrins that share a common beta 1 subunit〔J〕.J Biol Chem，1989；264(4)：380-9.

3 Ignotz RA，Massague J.Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix〔J〕.J Biol Chem，1986；261(9)：4337-45.

4 Livne E，Laufer D，Blumenfeld I.Osteoarthritis in the temparomandbular joint (TMJ) of aged mice and the in vitro effect of TGF-beta 1 on cell proliferation matrix synthesis,an alkaline phosphatase activity〔J〕.Microsc Res Tech，1997；37(4)：314-23.

5 Van Osch GJ，Van der Veen SW，Burger EH，etal.Chondrogenic potential of in vitro multiplied rabbit perichondrium cells cultured in alginate beads in defined medium〔J〕.Tissue Eng，2000；6(4)：321-30.

6 Kibe Y，Takenaka H，Kishimoto S.Spatial and temporal expression of basic fibroblast growth factor protein during wound healing of rat skin〔J〕.Br J Dermatol，2000；143(4)：720-7.

7 Kein MB，Yalamanchi N，Pham H.Flexor tendon healing in vitro：effects of TGF-beta on tendon cell collagen production〔J〕.J Hand Surg Am，2002；27(4)：615-20.

8 Decker R，Ibertsson-wikland K，Kristrom B，etal.Metabolic outcome of GH treatment in prepubertal short children with and without classical GH deficiency〔J〕.Clin Endocrinol (Oxf)，2010；73(3)：346-56.

〔2015-12-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省自然科学基金项目(No.201215199)

单 臣(1968-)，男，主任医师，主要从事周围神经及软组织损伤的研究。

王 虎(1972-)，男，副主任医师，主要从事足踝疾病诊治及四肢软组织损伤修复治疗研究。

R39

A

1005-9202(2016)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.009