江 芸 林有东 徐如梅 夏小平
(福建省立医院干部特诊二科,福建 福州 350001)
白细胞介素-10对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响
江 芸 林有东1徐如梅1夏小平2
(福建省立医院干部特诊二科,福建 福州 350001)
目的 探讨白细胞介素(IL)-10对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的影响。方法 取3个月自发性高血压大鼠胸主动脉细胞作为大鼠平滑肌原代细胞,细胞培养后分为IL-10组、空载体组、未处理组。加入细胞迁移诱导剂白细胞介素(IL)-1β。进行细胞划痕实验,Transwell实验,Snail转录因子mRNA荧光定量PCR,波形蛋白的表达测定。结果 IL-10组与其他两组相比,细胞迁移距离、细胞迁移数目、Snail转录因子mRNA的表达量、波形蛋白的表达均明显减少(P<0.05)。结论 IL-10抑制IL-1β诱导的大鼠胸主动脉VSMC迁移。
白细胞介素-10;Snail转录因子;波形蛋白
在动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的发生和发展过程中炎症反应贯穿全程,其中包括炎症因子的浸润及细胞迁移等,特别是主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)从血管中膜迁移至内膜是引起AS的重要因素之一〔1~3〕。在VSMC迁移过程中,多种细胞因子有明显的诱导迁移作用,如白细胞介素(IL)-1β等,而IL-10能抑制IL-1β诱导的VSMC迁移信号通路,从而对VSMC的迁移起到抑制作用,减轻ASCVD进程。因此,在治疗ASCVD时,抗炎药物治疗成为可能。
1.1 主要试剂 常规细胞培养用品为美国HyClone 公司或者杭州四季青公司产品;PCR引物由上海生工合成;RNA提取试剂盒TransZol UP为北京全式金产品;cDNA逆转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription system和荧光定量PCR试剂盒GoTaq®qPCR Master Mix均为Promega 公司生产;IL-1β细胞因子和Western波形蛋白特异性一抗购自Santa Cruz公司,Western配套试剂为碧云天产品。
1.2 动物 大鼠VSMC原代细胞取自3个月自发性高血压大鼠胸主动脉。大鼠雄性,SPF级,体质量200~250 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号SCXK(沪)2012-0002,质量合格证号2015000506388。动物使用协议已由审查委员会批准,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.3 主要仪器设备 Olimpus荧光倒置显微镜,Biorad荧光定量PCR仪和Western电泳仪,美国Molecular Devices公司酶标仪,美国Thermo公司细胞CO2培养箱,吴江市净化设备总厂医用超净工作台(YJ-875S/D-B型)。
1.4 细胞培养及迁移功能实验 用含10%胎牛和双抗的1640培养基置于5%CO2培养箱。(1)细胞划痕实验:细胞分成慢病毒IL-10转染组(IL-10组)、慢病毒空载体转染组(空载体组)和细胞培养对照组(未处理组),按5×105/孔的细胞数接种于六孔板过夜,第二天划痕后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次,再加2%胎牛血清的1640培养基2 ml,同时加IL-1β细胞因子(浓度10 ng/ml)作为细胞迁移的诱导剂,按0 h和48 h观察细胞迁移距离并拍照。(2)Transwell实验:先预处理Transwell小室,即分别用Matrigel包被小室底部膜的上室以及牛血清白蛋白(BSA)水化基底膜,细胞如前分组,实验前饥饿培养24 h后胰酶消化细胞再用含0.2%BSA无血清培养液重悬细胞密度至1×105个/ml。取细胞悬液200 μl加入Transwell小室,下室加入800 μl完全培养液培养48 h,取出Transwell小室,PBS清洗3次,用棉签小心擦去基质胶上层细胞,无水甲醇固定1 h,0.1%结晶紫染色2 h,倒置显微镜下计数每视野移至基质胶下层的细胞数,每个样本计数10个视野。
1.5 荧光定量PCR 细胞同上述分组。IL-1β诱导分别培养48 h后提取RNA,PCR按试剂盒说明书操作。按Δct计算方法进行相对定量。
1.6 Western印迹 细胞同上述分组。IL-1β诱导培养72 h后提取蛋白和定量后进行Western免疫印迹和显像。
1.7 统计学方法 应用SPSS17.0软件行单向方差分析。
2.1 细胞划痕实验 IL-10组慢病毒感染48 h后细胞迁移距离(4.10±0.40)cm,明显小于未处理组(5.03±0.17)cm和空载体组(5.04±0.2)cm(P<0.05)。见图1。
图1 细胞划痕实验结果
2.2 Transwell实验 IL-10组慢病毒感染48 h后基质胶下室细胞数(47±9)个,较未处理组(80±9)个和空载体组(77±5)个明显减少(P<0.05)。见图2。
图2 Transwell实验结果
2.3 Snail转录因子mRNA荧光定量PCR IL-10过表达组感染48 h后Snail转录因子mRNA的表达量(Δct=9.6±0.9)明显小于未处理组(Δct=7.6±0.4)和空载体组(Δct=7.7±0.3)(P<0.05)。
2.4 波形蛋白Western印迹检测结果 IL-10组慢病毒感染72 h后波形蛋白的表达(84.93±9.61)明显低于空载体组(108.10±5.99)和未处理组(112.90±9.28)(P<0.05)。见图3。
目前ASCVD的发病学说有血栓形成学说,脂质浸润学说,单克隆学说,损伤反应学说等,尚不能完全说明ASCVD的发病基础〔4〕。在ASCVD的发生、发展和演变过程中均有炎症反应参与〔5〕,其中包括炎症因子的浸润及细胞迁移等。特别是VSMC从血管中膜迁移至内膜是ASCVD进展的重要因素之一。
IL-1β等细胞因子在VSMC迁移过程中起重要的诱导作用,可诱导VSMC的迁移。Aguado等〔6〕证实IL-1β和血管紧张素2的协同作用具有很强的刺激血管平滑肌细胞迁移的作用,IL-1β是由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子,在细胞免疫激活中发挥调节作用。IL-1β是一种促炎症因子,在AS过程中,IL-1β表达增加,诱导VSMC组织蛋白酶S(Cat S)的表达,而Cat S能降解细胞外基质,诱导VSMC从血管中膜迁移至内膜〔2〕,加速AS进程。在大鼠动物实验中发现HUR(腺苷酸和鸟苷酸富集元件结合蛋白)通过增强炎症通路中关键分子人细胞外信号调节激酶(ERK)1/2的活性导致血管平滑肌细胞迁移造成血管内膜的重塑。最近也有学者报道IL-1β可能通过上调P2Y2受体水平促进血管平滑肌细胞的迁移〔7〕。因此本实验在探讨血管平滑肌细胞的迁移时亦使用IL-1β作为诱导剂。本文研究发现IL-1β刺激引起的细胞迁移及上皮细胞间质转化(EMT)过程中snail转录因子以及波形蛋白表达均增加,是细胞迁移的主要机制和重要指标〔8〕。本研究提示IL-10抑制IL-1β诱导的大鼠胸主动脉VSMC迁移。可能的机制是:IL-10是一种Th1细胞免疫抑制细胞因子,已知IL-10在体内最重要的来源是单核巨噬细胞和T辅助细胞,在各种介质的作用下激活后分泌IL-10。它是一种多细胞源性炎症抑制因子,能抑制单核细胞活性及炎症细胞迁移等减轻炎症反应〔9〕。IL-10能诱导核转录因子(NF-κB)的抑制性同源二聚体p50/p50进行核转位并与DNA结合从而减少NF-κB依赖的基因表达〔10〕,从而减少Cat S的表达,抑制VSMC的迁移,减轻ASCVD进程。内皮来源的一氧化氮(NO)是一种重要的血管重构调节剂。NO可抑制动脉粥样过程中的多个环节,IL-10能促进诱导型一氧化氮合酶基因的合成,NO合成增加,从而抑制VSMC的迁移〔11〕。人尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)是有丝分裂的氧化酶,IL-10基因敲除的大鼠通过上调NOX1来引起血管重塑(包括细胞迁移,增殖等)。因此考虑IL-10是通过抑制NOX1达到减轻血管重塑,抑制VSMC迁移的作用。
综上所述,IL-10明显抑制大鼠胸主动脉VSMC从血管中膜迁移至内膜,从而减缓ASCVD进程。
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〔2015-11-19修回〕
(编辑 袁左鸣)
福建省自然科学基金资助项目(2014J01287)
林有东(1972-),男,硕士,副主任技师,主要从事肿瘤分子生物学研究。
江 芸(1971-),男,硕士,副主任医师,主要从事心血管疾病研究。
R54
A
1005-9202(2016)21-5232-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.007
1 福建省立医院检验科 2 江西省上饶县人民医院