桃核承气汤对慢性肾衰大鼠BMP-7及MMP-2表达影响的研究

庄秀辉，张喜奎，危美红，苏美玲

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州350003）

桃核承气汤对慢性肾衰大鼠BMP-7及MMP-2表达影响的研究

庄秀辉1，张喜奎2，危美红1，苏美玲1

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州350003）

目的观察桃核承气汤对5／6肾切除大鼠BMP-7、MMP-2及TIMP-2表达的影响，探讨该方治疗慢性肾衰（CRF）的疗效机制。方法将5／6肾切除制造CRF大鼠模型，全自动动物血液分析仪测血常规，全自动生化分析仪测肾功能，免疫组化法测BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白的表达，Real－Time PCR法测BMP-7及MMP-2 m RNA的表达，同时进行光镜观察。结果与模型组比较，治疗组能显著升高RBC和HB（P＜0.05），显著降低血Scr和BUN（P＜0.05），明显提高BMP-7、MMP-2蛋白及m RNA的表达而抑制TIMP-2蛋白的表达（P＜0.05），并能在病理上减轻肾间质纤维化程度。结论桃核承气汤可通过上调BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表达，而下调TIMP-2蛋白的表达，促进细胞外基质的降解，从而减轻肾间质纤维化，延缓CRF进展。

肾间质纤维化；骨形态发生蛋白-7；基质金属蛋白酶-2；桃核承气汤

桃核承气汤是治疗太阳蓄血轻证的经方，经临床观察及实验研究发现：该方能改善肾功能，纠正贫血，延缓慢性肾衰（CRF）进展。本实验采用5／6肾切除方法制造CRF模型，通过观察桃核承气汤对5／6肾切除大鼠肾组织BMP-7、MMP-2及TIMP-2表达的影响，探讨该方治疗CRF的疗效机制。

1实验材料

1.1 实验动物7周龄SPF级的雄性SD大鼠60只，体重180～200 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号：SCXK（沪）2012-0002，动物合格证编号：2013001805578］，饲养于福建中医药大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2014-0005］。

1.2 实验药物桃核承气汤：生大黄12 g（后入），芒硝6 g（熔服），桃仁12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g。此饮片购于福建中医药大学附属第二人民医院，水煎并浓缩成42 g／100 mL的溶液，4℃保存备用；根据临床成人用量25 g／d，将尿毒清颗粒［康臣药业（内蒙古）有限责任公司，生产批号：20140913］配成25 g／100mL的溶液，4℃保存备用；青霉素（华北制药股份有限公司，生产批号：141219，规格为80万U／支）。

1.3 实验试剂肌酐检测试剂盒（C011-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮检测试剂盒（C013-2，南京建成生物工程研究所）；BMP-7免疫组化试剂盒（BS-2242R，北京博奥森生物技术有限公司）；MMP-2免疫组化试剂盒（BS04605R，北京博奥森生物技术有限公司）；TIMP-2免疫组化试剂盒（BS-0416R，北京博奥森生物技术有限公司）；二抗（SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒（ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术有限公司）；超纯RNA提取试剂（D9108B，日本TaKaRa公司）；反转录试剂盒（DRRO47A，日本TaKaRa公司）；Real-time PCR试剂盒（DRR420A，日本TaKaRa公司）；5x RNA Loading Buffer（DRR420A，日本TaKaRa公司）。

1.4 实验仪器全自动动物血液分析仪（XT-2000iV，希森美康医用电子有限公司）；石蜡切片机（RM2015，德国莱卡公司）；微量高速离心机（TG16W，长沙湘智离心机仪器有限公司）；显微镜（BX51T-PHD-J11，日本奥林巴斯公司）；低温冰箱（MDF-382E，日本三洋公司）；移液器（EPPENDORF，德国艾本德股份公司）；洗板机（AC8，芬兰Thermo Labsystems公司）；分光光度计（NANODROP 2000，美国Thermo Scientific公司）；荧光定量PCR仪（ABI7500，美国Applied Biosystems公司）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（Image-Pro Plus，美国Media Cybernetics公司）。

2实验方法

2.1 分组与造模大鼠购回饲养l周后，按随机数字表法分为空白组、假手术组、模型组、对照组和治疗组，每组各12只。空白组不予手术，假手术组仅做双肾包膜剥离，其余3组均行5／6肾切除手术。具体步骤如下：参照文献［1］，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，之后将其固定在鼠台上，在左肾部剪毛，常规消毒，戴手套，铺洞巾；在左肾部斜切2 cm，剪开皮肤、肌肉，将左肾从腹侧往切口托出，至充分暴露为止，剥离肾包膜，用止血钳钳住左肾肾蒂，以便暂时阻断左肾的血供，尽量切除2／3肾组织的上、下两极，然后用明胶海绵压迫止血，直至无明显出血，取下止血钳，复位残余肾脏，缝合各层组织；术后切口强力碘消毒，并在腹腔内连续3 d注射量为

7.2万U／100 g的青霉素；1周后进行第2次手术，在右肾部位做斜切口（而后步骤同上），结扎肾门，切除右肾（而后步骤同上）。

2.2 模型鉴定造模完4周后均以尾静脉采血用于比较各组大鼠的肾功能。结果显示：模型组、对照组和治疗组的血肌酐、尿素氮均明显高于空白组，表明造模成功。

2.3 给药干预造模完4周后每天上午给药，剂量均按临床成人每公斤体重用量的6倍换算。治疗组予灌42%的桃核承气汤溶液10 mL／（kg·d－1）；对照组予灌25%的尿毒清溶液10 mL／（kg·d－1）；其余3组分别给予灌等量生理盐水。给药时间为8周。

2.4 采集标本

2.4.1 检测血常规和肾功能给药后第57天将大鼠在腹腔麻醉下，腹主动脉采血6～8 mL。1号管：取2 m L血样，置于预先加好2%EDTANa2的试管中，摇匀后置于4℃、3 000转／min的离心机中离心10 min，吸取上层血浆，保存于-20℃冰箱中，用于测定血常规；2号管：取4mL血样置于不加任何抗凝剂的试管中静置，然后在4℃、3 000转／min的离心机中离心10min，吸取上层血清，置于-20℃冰箱中保存，用于测定肾功能。

2.4.2 肾组织取样采血后处死大鼠，取两块肾组织，分别放入4%多聚甲醛和RNA保存液中固定。前者备做蛋白检测和光镜观察，后者备做基因检测。

2.5 大鼠一般情况造模前各组大鼠体型丰满，反应灵敏，被毛密集，毛色光亮，饮食、二便均正常，体重未见明显变化。造模后模型组、对照组和治疗组大鼠体型瘦小，反应迟钝，活动量减少，皮毛蓬松，毛色枯槁，饮食及二便均减少，体重明显下降。大鼠死亡情况：空白组在实验的第5周死亡3只；假手术组分别在第1次和第2次的肾包膜剥离术后1周内各死亡1只，术后第5周死亡1只；模型组分别在第1次和第2次造模后1周内各死亡2只；对照组在第1次造模后1周内死亡3只，在第2次造模后1周内死亡1只，造模后第5周死亡1只；治疗组在第1次造模后1周内死亡1只，在第2次造模后1周内死亡2只，在造模后的第5周死亡1只。

2.6 实验室指标检测血常规检测采用全自动动物血液分析仪；血Scr检测采用除蛋白苦味酸比色法；BUN检测采用脲酶法；肾组织BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白表达检测采用免疫组化法；肾组织BMP-7、MMP-2及TIMP-2 mRNA表达检测采用Real-Time PCR法；光镜采用HE染色法观察。

2.7 统计学处理采用SPSS18.0软件包进行统计分析。计量资料均符合正态分布以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；用Testof Homogeneity of Variance检验方差齐性，若方差齐则用LSD检验，若方差不齐则用Games-Howell检验。

3实验结果

3.1 各组RBC、HB比较见表1。

表1 各组RBC、Hb比较（±s）

表1 各组RBC、Hb比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与对照组比较，3）P＜0.05。

组别空白组假手术组模型组对照组治疗组Hb／（g／L）161.58±1.88 161.81±2.38 105.54±4.621）127.92±3.852）128.66±2.443）n99878 RBC／（×1012／L）9.13±0.23 9.06±0.27 6.06±0.151）6.95±0.082）7.04±0.093）

3.2 各组血Scr、BUN比较见表2。

表2 各组血Scr、BUN比较（s）

表2 各组血Scr、BUN比较（s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与对照组比较，3）P＜0.05。

BUN／（mmol／L）6.27±0.95 6.39±0.61 25.86±2.941）16.75±2.632）12.09±1.283）组别空白组假手术组模型组对照组治疗组n99878血Scr／（μmol／L）69.84±6.89 68.35±7.51 177.06±7.031）133.74±10.052）96.78±8.083）

3.3 各组BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表达结果比较见表3。

表3 各组BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表达结果比较（±s）

表3 各组BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表达结果比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与对照组比较，3）P＜0.05。

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3.4 各组BMP-7、MMP-2 mRNA相对表达量比较见表4。

3.5 病理观察光镜下显示：空白组与假手术组肾组织形态结构均清晰可见，肾小球和肾小管均未

见萎缩性病变，肾间质也未见纤维增生；模型组肾组织形态结构大都消失，细胞排列分布参差不齐，多数肾小球皱缩、变硬，肾间质多呈大片状纤维化，肾小管萎缩或扩张，甚或消失；对照组肾组织有部分结构消失，细胞排列分布较紊乱，肾小球少许皱缩、变形，肾间质纤维组织少量增生，可见部分肾小管扩张；治疗组肾组织形态结构大致正常，细胞排列分布尚整齐，肾小球形态结构较正常，肾间质多无纤维增生，肾小管未见明显病变。见图1。

表4 各组BMP-7、MMP-2mRNA相对表达量比较（±s）

表4 各组BMP-7、MMP-2mRNA相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与对照组比较，3）P＜0.05。

4讨论

近年来许多医家认为CRF主要病机是邪毒深入营血，化热成毒，而致肾络瘀阻［2］。研究发现：毒邪与瘀血贯穿CRF的始终，二者互相转化，可胶结成瘀毒［3］。还有学者提出要从瘀论治CRF［4］。张喜奎教授［5］认为CRF病在厥阴形成的下焦瘀水互结证，与《伤寒论》所述的蓄血证类似。赵绍琴教授［6］认为CRF基本病机为湿热深入营血，日久形成瘀毒。马进教授［7］亦认为瘀血内阻、日久成积是CRF的主要病机。桃核承气汤化瘀解毒、通腑泻浊，契合CRF主要病机特点，方中桃仁能破血行瘀，去宛陈莝，使CRF瘀阻的肾络畅通，从而改善肾功能。如李小波等［8］通过实验研究表明：桃仁有一定的抗肾间质纤维化和保护肾小管功能作用；大黄通腑泻浊，与桃仁共为君药，现代研究［9］表明：大黄可促进有毒代谢产物的排出；芒硝能泻热软坚，桂枝能温阳通脉，既可助桃仁祛瘀解毒，又可制约大黄及芒硝寒凉之弊，与芒硝共为佐药；炙甘草补中益气，调和诸药。

CRF的进展过程主要包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化等。若一旦形成肾间质纤维化就预示着进展至CRF的必然性，其轻重程度更能反映肾脏病的病情演变及预后［10］。而肾间质纤维化多与细胞外基质（ECM）过度蓄积于正常肾组织有关，其形成的主要机制是ECM合成过度及降解受到抑制。ECM降解涉及多种蛋白酶，其中基质金属蛋白酶（MMPs）和其特定的组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是比较重要的酶类［11］。MMP-2对ECM起特异降解作用，TIMP-2对MMP-2起抑制作用。骨形态发生蛋白-7（BMP-7）能保护肾功能，其活性升高能减轻肾间质纤维化。研究发现：BMP-7可提高MMP-2的表达，使ECM积聚减少，从而减轻肾间质纤维化［12］。现代医学已证实：在CRF进程中始终存在高凝状态，导致肾小球滤过率（GFR）下降等，相当于中医之“浊毒瘀血”。桃核承气汤立法处方与CRF病机相符，本实验结果显示：桃核承气汤能显著升高RBC计数及Hb含量，显著降低血Scr和BUN水平，提高BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表达而抑制TIMP-2蛋白的表达，并能在病理上减轻肾间质纤维化程度。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0037-03

2016－05－15

2013年度福建省中医药科技项目（wzsb201302）

庄秀辉（1988—），男，医学硕士，研究方向：中医肾病研究。

张喜奎（1963—），男，主任医师，硕士生导师。E-mail：zhxk1963@aliyun.com