全细胞催化PET生物降解性能的研究

王宏阳，巩继贤，李育强，张健飞

(1. 天津工业大学纺织学院，天津 300387；2. 天津工业大学先进纺织复合材料教育部重点实验室，天津 300387)



全细胞催化PET生物降解性能的研究

王宏阳1,2，巩继贤1,2，李育强1,2，张健飞1,2

(1. 天津工业大学纺织学院，天津 300387；2. 天津工业大学先进纺织复合材料教育部重点实验室，天津 300387)

生物催化作为生物技术的一个重要发展方向，在材料加工和处理方面开始发挥越来越重要的作用。针对全细胞对高聚物PET的生物降解过程开展研究，以PET为碳源，通过检测菌株的生物量的变化、发酵液中产物的种类与浓度变化，以及PET降解前后结晶度的影响和粒径的变化，研究全细胞对PET的降解过程。结果表明，全细胞对PET有一定的降解能力，PET在降解后的粒径变小，结晶度升高，降解过程产生多种中间物质。

全细胞 生物降解 粒径

PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)在自然界中预测其存在周期为16年到48年，被认为是比脂肪族聚酯更难生物降解的芳香族聚酯[1]。当前，生物催化降解已经从以传统的小分子作为底物的研究，扩展到能够以高分子聚合物作为底物的生物降解。由于PET具有优良的物理和化学性能，被广泛的应用于各个行业，其废弃物的累积已经成为一个全球关注的热点。

国内外科研工作者从小分子对苯二甲酸(Terephthalate acid，TA)[2, 3]研究，到以对苯二甲酸二乙酯(Diethyl terephthalate，DTP)[2, 4]和3PET[5]等PET模拟物和脂肪族-芳香族共聚物[6]作为底物探究PET的生物降解能力，并取得了一定的成果。然而直接以PET为底物，因酶的特性和PET自身结构性能的限制，生物降解效果不理想。本文为研究全细胞对PET颗粒的降解性能，以PET为唯一碳源进行生长的分解菌为出发菌株，通过菌株生物量的变化、发酵液中产物种类与浓度变化，分析了底物颗粒降解前后结晶度的变化以及底物粒径对菌株的生长和降解过程的影响。

1 实验部分

1.1 菌株

睾丸酮丛毛单胞菌，天津工业大学纺织学院生态染整课题组培育。

1.2 试剂与药品

PET切片(西格玛奥德里奇中国公司)；对苯二甲酸(terephthalicacid，TA)(天津市光复精细化工研究所)；苯甲酸(benzoic acid，BA)(天津市化学试剂三厂)；双(2-羟基乙基)对苯二甲酸酯(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate，BHET)、原儿茶酸(protocatechuic acid，PA)(天津市希恩斯生化科技有限公司)；粘康酸(muconic acid，MA)(阿法埃莎化学有限公司)；磷酸、甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)。

1.3 仪器与设备

HZQ-Q型全温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；WND-100型高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)；LC-15C型反向高效液相色谱仪(HPLC)(日本岛津有限公司)；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；V-1200型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；DL-101-2ES型电热鼓风干燥箱(天津市中环实验电炉有限公司)；D8 DISCOVER GADDS型X射线衍射仪(XRD)(德国Bruker AXS公司)；扫描电镜TM-1000(日本日立)。

1.4 实验方法

1.4.1 PET超细粉体颗粒的制备

取一定量PET切片，150℃烘干36h，充分干燥，转入高速中药粉碎机粉碎加工，再用360目标准筛网过筛制得。

1.4.2 PET分解菌培养降解

培养基的配制参照文献方法[7]：准确称取NH4Cl 1g、KH2PO43g、Na2HPO47g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.25g、H3BO30.5μg、FeCl3·6H2O 0.2μg、MnSO4·5H2O 0.4μg、ZnCl20.4μg、CuSO4·5H2O 40μg、(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.2μg及水1000mL，充分溶解后量取100mL加入到500mL锥形瓶中，120℃灭菌20min。

菌株的培养：称取0.1g PET粉末添加到灭菌后培养基中，转接20mL出发菌株培养液，37℃，140rpm/min振荡培养，定期取样测试。

1.5 测试方法

1.5.1 生物量的检测

通过可见分光光度计测量微生物发酵液的光密度(OD值，optical density)来表示菌液的浓度，即每隔一定时间将菌株摇瓶取出，静置4～6min，取锥形瓶中部发酵液3mL置比色皿中，观察可见分光光度计波长为600nm的吸光度。

1.5.2 发酵液中产物的检测

培养过程中每隔一定时间取样2mL留做高效液相色谱测试。色谱条件：色谱柱：InertSustain C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流速：1mL/min；进样体积：1μL；检测波长：240nm；流动相pH为2.02的60% CH3OH-0.05mol/L KH2PO4(V/V)缓冲溶液。

1.5.3 X射线衍射

采用德国Bruker AXS公司的D8 DISCOVER GADDS型X射线衍射仪对经过菌株处理前后的不同粒径PET粉末的结晶行为进行分析。2θ范围设为(4～40)°。

1.5.4 粒度分布测试

采用Delsa Nano C粒径分析仪(BECKMEN COULTER)，乙醇分散体系。将PET样品分散在乙醇溶液中，超声震荡5min，待粉末分散均匀后取出待测。

2 结果与讨论

2.1 分解菌利用PET的生长特征

底物的分解和摄入为菌株的生长代谢提供碳源，生长情况也反映出菌株对底物的利用效率。PET超细粉末，作为底物进行PET分解菌的培养。菌株生长情况能够表示微生物对底物的利用率，但这对高聚物底物的生物催化分解情况，只是间接的反映。底物对菌株生长的影响情况如图1所示。

图1 PET分解菌的生长曲线

图1所示的结果表明，PET粉末作为底物被菌株分解，整个生物量呈现出波动的变化。不能像葡萄糖等可溶性小分子类常规底物能够被微生物直接摄入细胞内，而进入代谢系统。是因为PET这样的不溶性高聚物作为底物，不能直接被细胞利用。研究指出[3, 4]，在以聚酯类物质作为底物的生物过程中，首先需要细胞分泌出一定的胞外酶。在酶的催化作用下，聚合物的大分子链发生化学键的断裂和分解。随着生物催化分解反应的进行，会陆续产生短链物质。当分子链足够短的时候，这些分解产物就可以溶解在发酵液中，成为可溶性物质。这些可溶性小分子产物可以被细胞摄入，参与细胞内的代谢过程。

2.2 PET分解中间产物的变化

为获得微生物培养条件下，PET生物催化分解的直接信息，PET超细粉末作为底物，进行PET分解菌的培养，培养一定时间后对发酵液取样分析，得到不同时刻发酵液样品的HPLC谱图。结果如图2所示：

图2 不同时刻发酵液中PET分解中间产物的液相色谱

如图2所示，全细胞降解PET不同时刻的发酵液的液相色谱图谱，与其他酶制剂降解PET相比，菌株降解PET底物的中间产物种类更加丰富。由图2可知，随着培养时间的延长，PET分解出中间产物的变化并不是成线性积累增加，而是产生了一定的波动现象，在培养至24h后产物浓度达到一定高水平，48h处又降低到低水平，最后在72h处又开始增加，这些波动变化足以说明菌株全细胞作用PET更加复杂，中间产物之间的分解关系更加复杂。通过对比标准物质出峰时间，我们发现在实验色谱条件下，发酵液中的主要产物为保留时间(retention time，rt)为rt=3.28min的MA、rt=6.33min的BA以及rt=4.01min处出峰，推测是以对苯二甲酸为主的物质(TA-m)(TA、3-羟基苯甲酸、BHET)。通过HPLC谱图可知，在菌株培养过程中，MA、BA、TA-m这些物质所形成的峰面积比较大，即这些物质在发酵液中的浓度相对较大。随着培养时间的延长，PET的分解产物浓度变化幅度明显不同，其中MA和TA-m的浓度一直相对较大，说明微生物对PET的降解产物作用主要集中在MA和TA-m的降解利用上。

对于高聚物的生物转化作用来说酶的催化效率是一个限制性因素，即便在全细胞的生物催化过程中。据相关报道[8]，某种中间产物在酶浓度较低的情况下不能被分解，当过量的酶存在时能够被很好地分解。本研究中伴随着微生物的生长繁殖，发酵液中胞外酶的浓度提高，可以显著提升PET降解的效率，而传统单一酶制剂会随着分解作用的发生而逐渐消耗。全细胞生物能够分泌各种各样的复合酶，借助于这些复合的酶催化PET底物产生各种各样的中间产物，因此全细胞生物加工PET的过程中会产生种类丰富的中间产物。

2.3 分解菌对PET结晶度的影响

根据文献报道[9]，经过酶处理的PET结晶度显著提高，说明大分子的非晶区更容易受到酶分子的作用而发生降解作用。而我们采用菌株发酵液对粒径小于25μm的PET颗粒进行三周的降解处理，定期补加新鲜菌液，最后收集底物粉末进行XRD测试。测试结果如图3所示：

图3 PET经菌株处理前后的XRD变化

图3中两条曲线分别代表降解菌对PET颗粒处理前后的XRD曲线，可以明显，曲线的衍射峰出峰位置和形状基本没有变化，这说明物质本身并没有发生晶体结构的变化。但是，经过菌株处理的样品衍射峰的强度有所增加。同时通过对谱图的数据处理分析发现，经过三周菌株处理，PET颗粒的结晶度增大了5.03%。由此可知：菌株对PET颗粒有一定的降解作用，主要集中在分子链运动相对活跃的无定形区域发生有效分解，从而导致PET颗粒结晶度增加。

2.4 分解菌对PET粒径结构的影响

纳米颗粒的尺寸与酶分子尺寸之间的比率会影响酶对其吸附行为，进而影响催化降解效果。为研究菌株对PET颗粒的降解作用，本实验对菌液处理前后的较小粒径的PET颗粒进行粒径测试，结果如图4所示：

图4 PET生物降解前后的粒径分布变化

由图4可知底物PET颗粒的直径分布较为广泛(100nm～1500nm)，而酶分子的尺寸约为10nm，远大于酶分子直径，因此酶分子只能随机吸附在PET颗粒表面。当底物尺寸与酶分子的比率越大，则酶分子对底物的有效覆盖面积越小；当底物尺寸与酶分子的比率越小，则酶分子对底物的有效覆盖面积越大。酶分子越是充分覆盖PET底物，降解效率就越高。实验中，经过菌液处理后的PET颗粒粒径集中于较窄的分布范围，说明酶分子作用于底物表面使得PET尺寸减小。分析主要原因是PET颗粒结晶程度较低，非晶区结构占据主要，较大颗粒PET经过酶分子的吸附后，只在某个部位产生催化降解，使得PET表面碎片化，进而直径减小；而粒径较小时，酶分子对PET颗粒的有效覆盖面积增加，对其催化降解程度提高，所以分解较为充分。推测全细胞生物降解PET属于剥皮式降解。

2.5 分解菌的全细胞生物催化过程

图5 全细胞生物催化PET的生态体系

图5展示了全细胞生物催化PET的整个生态体系。首先，PET降解菌在底物碳源的刺激下分泌出多种胞外酶，酶分子吸附在PET颗粒表面，大分子链发生化学键的断裂。随着生物催化分解反应的进行，会陆续产生短链物质。当分子链足够短的时候，这些分解产物就可以溶解在发酵液中，成为可溶性物质。最终这些可溶性小分子产物被细胞摄入，参与细胞内的代谢过程，促进菌株的生长繁殖。

3 结论

全细胞生物催化PET降解过程中，菌种能够以PET为唯一碳源进行生长，降解过程更为复杂，能够催化降解PET多种分解产物。同时PET颗粒在经过三周处理后其结晶度增大了5.03%，由于PET非晶区域高分子链段相对较为活跃，降解行为容易发生，从而导致结晶度增大。底物的PET超微颗粒的粒径结构在菌株处理后，其颗粒的粒径有所减小，表明PET具有生物分解性能，分解产物能够促进菌株生长。从全细胞角度分析，聚酯生物分解过程比直接用酶处理底物更复杂，因此对菌株、酶、PET和产物四者作用体系的研究还较为缓慢，主要原因是缺乏对高聚物PET高效降解的菌株。

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Research on Whole-cell Catalyzed PET Biodegradability

WANGHong-yang1,2,GONGJi-xian1,2,LIYu-qiang1,2,ZHANGJian-fei1,2

(1. College of Textile, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387; 2. Key Laboratory of Advanced Textile Composites of Ministry of Education,Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387)

As an important development direction of biotechnology, biocatalysis plays a more and more important role in material processing and handling. The research aiming at the biodegradation process of whole-cell to PET(poly(ethylene terephthalate)) was carried out. Taking PET as carbon source, by detecting the biomass change of strain, the species kinds of products in fermented liquid and concentration change, the influence of PET crystallinity and change of particle size before and after degradation, the degradation process of whole-cell to PET was studied. Results showed that whole-cells had certain degradability to PET, the particle size became smaller and crystallinity became higher after degradation of PET, and a variety of intermediate substances were produced during the degradation process.

whole-cell biodegradation size

2016-08-17

王宏阳(1990-)，男，博士研究生，研究方向：聚酯材料的生物改性。

O63，Q819

A

1008-5580(2016)04-0028-05