生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒X蛋白的关系

彭桦，何前进，金涛，李常海

(1 华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2 黄冈市中心医院；3 华中科技大学同济医学院附属同济医院)



生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒X蛋白的关系

彭桦1，何前进2，金涛1，李常海3

(1 华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2 黄冈市中心医院；3 华中科技大学同济医学院附属同济医院)

目的 探讨生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌中的表达及其与乙肝病毒X蛋白(HBx)的关系。方法 选择60例HBV相关肝癌患者，取其癌组织及癌旁正常组织，采用免疫组化法观察Timeless的表达，分析Timeless表达与患者临床病理参数的关系。取人正常肝细胞系LO2、肝癌细胞系HepG2，分别转染pcDNA3.1-HBx质粒和pcDNA3.1质粒，采用Real-time PCR和Western blotting法检测细胞内Timeless mRNA及其蛋白表达。结果 肝癌组织及癌旁正常组织Timeless阳性表达率分别为60.0%(36/60)、38.3%(23/60)，二者比较P<0.05。Timeless阳性表达与肝癌患者血管侵犯有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤组织分化程度、血清AFP水平无关(P均>0.05)。转染pcDNA3.1-HBx质粒的HepG2细胞和LO2细胞Timeless mRNA及其蛋白相对表达量均明显高于转染pcDNA3.1质粒细胞(P均<0.05)。结论 HBV相关肝癌组织中Timeless高表达，其表达变化与HBV相关肝癌的发生、发展有关；HBx可能是引起Timeless表达升高的原因之一。

肝细胞癌；Timeless；乙型肝炎病毒；乙肝病毒X蛋白

细胞内的生物钟由多个生物钟基因共同精密调控[1～3]。研究发现，生物钟紊乱与某些肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等[4～7]。HBV感染是我国肝癌的首要致病因素，其编码产物乙肝病毒X蛋白(HBx)是肝癌发生、发展的重要推动因子[8，9]。近年研究发现，HBx可导致生物钟基因昼夜节律运动输出周期故障基因(clock)、脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(Bmal1)、周期蛋白(Period 1～3)的表达异常，推测HBx可能是导致肝癌细胞中生物钟基因表达紊乱的原因之一[10]。Timeless基因是近年新发现的一种生物钟基因，其在肝癌组织中表达的报道较少，且研究结果不一，其作用机制亦未完全清楚[11，12]。为此，2006年8月～2012年7月，我们进行了以下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 选择同期黄冈市中心医院收治的肝癌患者60例，均经术后组织病理检测明确诊断。其中，男44例、女16例，年龄25～68岁、平均52.6岁；肿瘤组织分化程度：高分化16例，中分化27例，低分化17例；肿瘤直径≥5 cm 32例，<5 cm 28例；血清AFP水平≤200 ng/mL 33例，>200 ng/mL 27例；有血管侵犯19例，无血管侵犯41例。所有患者血清乙肝表面抗原阳性，丙肝核心抗体阴性，术前未接受放疗、化疗、生物靶向治疗及其他治疗。人正常肝细胞系LO2、肝癌细胞系HepG2购自中国典型物种保藏中心。pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1表达载体，由华中科技大学同济医学院附属同济医院保存。TRIzol试剂、Lipofectamine 2000(脂质体转染剂)和SYBR® Green PCR Master Mix，购自美国Life公司，PCR引物合成亦由Life公司完成。CO2培养箱，购自德国Heraeus公司；BX51型倒置相差显微镜、FV300型荧光显微镜，购自日本奥林巴斯公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，购自美国赛默飞世尔科技公司，Mini Protean 3 Cell型蛋白质电泳仪，购自美国Bio-Rad公司。

1.2 肝癌组织及癌旁正常组织Timeless表达检测 取患者手术切除的肝癌组织及癌旁正常组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。切片脱蜡至水，PBS洗涤10 min。3% H2O2室温浸泡10 min。PBS洗涤3次，每次2 min。置于pH 9.0的缓冲液中，92～98 ℃微波加热抗原修复20 min，常温冷却，PBS洗涤3次，每次2 min。用10%山羊血清37 ℃封闭1 h。弃去封闭液，直接滴加一抗(Timeless多克隆抗体1∶250稀释)，4 ℃冰箱下孵育过夜。复温后PBS洗涤3次，每次2 min。滴加1∶20稀释的生物素化二抗羊抗兔IgG-HRP，37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加DAB，纤维镜下控制显色，自来水中止反应，苏木素复染，脱水、封片。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。Timeless阳性染色定位于细胞质及细胞核，为黄色、棕黄色或褐色。根据染色强度和阳性细胞所占比例综合计分。染色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，阳性细胞所占比例≤25%为1分，>25%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分。二者乘积>4分为Timeless阳性表达[13]。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养及质粒转染 分别取2×105个HepG2细胞和LO2细胞，接种于6孔板中，加入含10% FBS的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养，待细胞生长至60%～70%融合时行HBx转染。两种细胞均分别转染pcDNA3.1-HBx质粒和pcDNA3.1质粒。转染HBx质粒细胞加入1.2 μg pcDNA3.1-HBx质粒，转染pcDNA3.1质粒细胞加入1.2 μg pcDNA3.1质粒。转染pcDNA3.1-HBx质粒细胞检测到HBx mRNA及其蛋白表达，而转染pcDNA3.1质粒细胞则无HBx mRNA及其蛋白表达，表明转染成功。转染过程遵照Lipofectamine 2000说明书进行。转染24 h收集细胞，提取细胞mRNA和总蛋白用于后续试验。

1.3.2 肝细胞Timeless mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。按照TRIzol试剂说明书提取LO2、HepG2细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度合格后，取2 μg mRNA逆转录为cDNA。经预实验，将逆转录后的cDNA 5倍稀释作为模板。在GenBank上查询Timeless mRNA序列(NM_003920.3)，通过Primer premier5.0软件进行引物设计。Timeless引物序列：上游引物5′-AGTCTTCTGCCTCTTCAATCGTC-3′，下游引物5′-AGCCATAGCCCTCAGTCATCTC-3′；内参β-actin引物序列：上游引物5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′。总反应体系为25 μL，反应条件参照文献[14]。按照SYBR® Green PCR Master Mix(2×)说明书进行定量PCR反应，每个样本设3个复孔。反应完成后在ABI7500软件系统中调整基线和阈值，读出各反应孔Ct值。Ct值代表基因的起始拷贝数，可根据Ct值比较基因的表达量并计算基因表达变化倍率。变化倍率=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(目的基因Ct-内参基因Ct)/(阴性对照Ct-内参基因Ct)。

1.3.3 肝细胞Timeless蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集LO2、HepG2细胞，提取总蛋白，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到PVDF膜上，根据试剂盒说明书进行操作，ECL化学发光法显色，X线曝光，图像分析软件分析各样品显色灰度，计算灰度值，以β-actin为内参照。所测蛋白的灰度值与内参照灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁正常组织Timeless阳性表达比较 肝癌组织及癌旁正常组织Timeless阳性表达率分别为60.0%(36/60)、38.3%(23/60)。肝癌组织Timeless阳性表达率明显高于癌旁正常组织(χ2=5.635，P<0.05)。

2.2 肝癌组织Timeless阳性表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 肝癌组织Timeless阳性表达与患者临床病理参数的关系

2.3 HBx转染后肝细胞Timeless mRNA及其蛋白相对表达量比较 见表2。

表2 HBx转染后肝细胞Timeless mRNA及其蛋白相对表达量比较±s)

注：与同种细胞转染pcDNA3.1比较，*P<0.05。

3 讨论

人体细胞生物钟在分子水平上由clock、Bmal1、Period等多个生物钟基因精确调控[1]。这些基因构成两种重要的反馈回路：①生物钟核心因子clock通过bHLH-PAS结构域与Bmal1形成异二聚体，与Period 1～3和Cry 1、2基因启动子上的E盒相结合并激活其转录，编码产物Period 1～3和Cry 1、2蛋白由细胞质转移至细胞核内，与clock/Bmal1直接结合并抑制其活性，进而阻遏Period 1～3和Cry 1、2的转录[1]；②clock与Bmal1形成的异二聚体除激活Period 1～3和Cry 1、2基因转录外，也可激活孤儿核受体Rev-Erb基因的转录。Rev-Erb基因编码蛋白可与Bmal1启动子相结合并阻遏其转录[1]。由于基因转录、翻译及蛋白入核需要一定时间，使生物节律分子振荡以近24 h为周期自律进行，生物钟基因这种负反馈循环构成人体内精确的内源性“分子钟”。人体内的“分子生物钟”紊乱可导致细胞增殖和凋亡紊乱，细胞生长失控，进而导致肿瘤形成。流行病学调查发现，经常熬夜人群中乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的发病率明显高于不熬夜人群[1]。动物实验亦证实，生物钟紊乱可加快肿瘤的发生、发展[15]。

1994年Sehgal等[16]在果蝇中筛选出了影响生物节律的新突变体，其对生物节律的影响与Period相似，与这一突变体对应的野生型基因被称为Timeless基因。Timeless可与Period 1～3结合，进而进入细胞核，抑制clock基因的活性，降低clock基因表达，从而终止生物钟周期[16]。研究发现，Timeless是小鼠胚胎发育过程中的重要基因之一，在胚胎发育初期广泛表达于心、脑、肝、肺等器官，其缺失可导致胚胎死亡率升高[16]。近年研究发现，Timeless在肺癌和结直肠癌中表达升高[17]；但其在肝癌组织中表达的报道较少，结论也不一致。如Lin等[11]报道，Timeless在肝癌组织中低表达；而Elgohary等[12]报道，其在肝癌组织中高表达。其原因可能为肝癌是一个异质性较大的肿瘤，不同病因导致的肝癌在基因表达上存在较大差异。本研究结果显示，Timeless在肝癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，与Elgohary等[12]研究结果一致。进一步分析Timeless与肝癌患者临床病理参数的关系发现，Timeless阳性表达在有血管侵犯的肝癌组织高于无血管侵犯的肝癌组织，亦与Elgohary等[12]研究结果吻合。表明Timeless可能参与了肝癌的发生、发展。

HBV与肝癌的发生、发展密切相关，其编码产物HBx是肝癌发生、发展过程中的重要推动因素[18]。有研究发现，HBx可引起生物钟基因clock、Bmal1、Period 1～3等异常表达，但对HBx与Timeless的关系鲜见报道[19，20]。本研究结果显示，HBx可上调正常肝细胞(LO2)和肝癌细胞(HepG2)Timeless表达。由此推测，HBx可能是引起肝癌组织中Timeless表达升高的原因之一。HBx诱导Timeless表达升高引起的肝脏细胞生物钟紊乱可能是HBx推动肝癌发生、发展的机制之一。Timeless高表达与肝癌血管侵犯密切相关，因此其亦参与HBx介导的肝癌侵袭和转移[13]。关于HBx上调Timeless的详细机制还有待进一步深入研究。

综上所述，Timeless在HBV相关肝癌组织中高表达，且与血管侵犯相关，提示Timeless高表达可能与HBV相关肝癌的发生、发展有关；HBx可能是引起肝癌组织中Timeless表达升高的原因之一。今后我们将继续增加样本量并检测HBx在非HBV相关肝癌中的表达来验证这一观点，同时观察Timeless与肝癌患者预后的关系，为肝癌的防治提供新的思路。

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Expression of Timeless in HBV-related hepatocellular carcinoma and its relationship with hepatitis B virus x protein

PENGHua1,HEQianjin,JINTao,LIChanghai

(1LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430077,China)

Objective To investigate the expression of circadian clock gene Timeless in hepatitis B virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC) and its correlation with hepatitis B virus x protein (HBx). Methods Immunohistochemistry was employed to detect the expression of Timeless in 60 cases of HCC tissues and adjacent normal tissues. Then we analyzed the relationship between the expression of Timeless and clinic pathological features in HCC patients. Meanwhile, both pcDNA3.1-HBx and pcDNA3.1 were transfected into LO2and HepG2cell lines, respectively. Real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression of Timeless mRNA and protein. Results The protein expression levels of Timeless in HCC tissues and adjacent normal tissues were 60.0% (36/60) and 38.3% (23/60), respectively; and significant differences were found (P<0.05). The expression of Timeless in HCC tissues was associated with vascular invasion (P<0.05), was not related with sex, age, level of serum AFP (allP>0.05). HepG2and LO2cell lines transfected with pcDNA3.1-HBx plasmids demonstrated higher protein and mRNA expression levels of Timeless as compared with those transfected with pcDNA3.1 plasmids (allP<0.05). Conclusion High expression of Timeless may be related to the occurrence and progression of HBV-related HCC, and HBx may be one of the reasons that causes the high expression of Timeless.

hepatocellular carcinoma; Timeless; hepatitis B virus; hepatitis B virus x protein

彭桦(1981-)，男，主治医师，研究方向为腹部外科。E-mail: 2300836708@qq.com

简介：何前进(1977-)，男，主任医师，研究方向为肝胆外科。E-mail： 44223706@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.006

R735.7

A

1002-266X(2016)40-0021-04

2015-11-01)