HPLC测定十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸含量

武琳，杨光，杜菁，刘莹

北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，北京 100079

HPLC测定十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸含量

武琳，杨光，杜菁，刘莹

北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，北京 100079

目的建立十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸的含量，采用Zorbax SB C18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-2.5%醋酸（65∶35)，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm。结果甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝1），十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸平均回收率分别为99.85%（n＝6）、100.70%（n＝6）、100.81%（n＝6）。结论本试验所建立的方法专属性强、简便，可用于含甘草成分的产品中甘草酸的检测。

十全大补丸；补中益气丸；银翘解毒片；甘草酸；高效液相色谱法

十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片为北京同仁堂科技发展股份有限公司出口至欧洲某国家产品，处方中均含有甘草成分。进口方卫生署要求含甘草成分的产品应做甘草酸检测，并规定甘草酸每日服用量不应超过100 mg。本试验采用HPLC对十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸进行含量测定，对十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片的质量标准进行提高完善，从而有效控制制剂质量，保证出口产品质量，保证临床疗效及用药安全。

1　仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；METTLER TOLEDO AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司），KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率40 kHz）。

甘草酸铵对照品（供含量测定用，批号110731-200614），中国食品药品检定研究院；十全大补丸（批号8030953、0030631、4035575）、补中益气丸（批号0081764、8081758、0081768）、银翘解毒片（批号0121031、0121030、0121032），北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；配制溶液所用试剂均为分析纯，HPLC用试剂为高效液相级，水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Zorbax SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-2.5%醋酸（65∶35），流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于2000。

2.2对照品溶液的制备

取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（甘草酸质量＝甘草酸铵质量/1.0207）[1]。

2.3供试品溶液的制备

分别取十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片适量，研细，分别取约3、0.5、0.6 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定质量，分别超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40、50、40 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，离心，分别取上清液，即得。

2.4阴性对照溶液的制备

按十全大补丸、补中益气丸和银翘解毒片处方中药味比例，分别自配不含甘草的其他药材，按其制备工艺制成阴性制剂，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5空白干扰试验

精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果甘草酸可与其他成分基线分离，阴性对照溶液在与甘草酸对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为空白无干扰。色谱图见图1。

2.6线性关系考察

分别精密吸取0.184 mg/mL甘草酸铵对照品溶液（折合甘草酸浓度为0.180 3 mg/mL）1、4、7、10、13、16、20 μL，注入液相色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝942.3X－4.955（r＝1），结果表明，甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，可用外标一点法计算。

2.7精密度试验

分别取十全大补丸、补中益气丸和银翘解毒片同一供试品溶液，分别连续进样6次，计算得甘草酸峰面积的RSD分别为0.69%、1.03%和0.46%，表明仪器精密度良好。

2.8稳定性试验

分别精密吸取十全大补丸、补中益气丸和银翘解毒片同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定。结果十全大补丸中甘草酸平均含量为0.75 mg/g，RSD＝1.48%；补中益气丸中甘草酸平均含量为3.35 mg/g，RSD＝0.72%；银翘解毒片中甘草酸平均含量为3.20 mg/g，RSD＝1.20%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

图1　十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸HPLC图

2.9重复性试验

分别精密称取十全大补丸同一批号（8030953）样品6份、补中益气丸同一批号（0081764）样品6份、银翘解毒片同一批号（0121031）样品6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果十全大补丸中甘草酸平均含量为0.74 mg/g，RSD＝1.01%；补中益气丸中甘草酸平均含量为3.34 mg/g，RSD＝0.98%；银翘解毒片中甘草酸平均含量为3.17 mg/g，RSD＝0.56%。表明本方法重复性良好。

2.10加样回收率试验

精密称取已知含量的十全大补丸同一批号供试品（批号8030983，甘草酸含量为0.74 mg/g）约1.5 g，精密加入0.020 6 mg/mL甘草酸铵对照品溶液50 mL；精密称取已知含量的补中益气丸同一批号供试品（批号0081764，甘草酸含量为3.34 mg/g）约0.25 g，精密加入0.018 4 mg/mL甘草酸铵对照品溶液50 mL；精密称取已知含量的银翘解毒片同一批号供试品（批号0121031，甘草酸含量为3.17 mg/g）约0.3 g，精密加入0.019 2 mg/mL甘草酸铵对照品溶液50 mL。按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定甘草酸含量。结果十全大补丸平均回收率为99.85%（n＝6），RSD＝2.49%；补中益气丸平均回收率为100.70%（n＝6），RSD＝1.72%；银翘解毒片平均回收率为100.81%（n＝6），RSD＝1.19%。结果见表1～表3。

表1　十全大补丸中甘草酸加样回收率试验

表2　补中益气丸中甘草酸加样回收率试验

表3　银翘解毒片中甘草酸加样回收率试验

2.11样品含量测定

分别取十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片各3批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每批测定3次，用外标一点法计算，结果见表4～表6。

表4　十全大补丸样品中甘草酸含量测定结果（n＝3）

表5　补中益气丸样品中甘草酸含量测定结果（n＝3）

表6　银翘解毒片样品中甘草酸含量测定结果（n＝3）

3　讨论

甘草中甘草酸的测定方法较多[2-3]，经过比较，选择HPLC对甘草酸进行测定。本试验参考2005年版《中国华人民共和国药典》（一部）甘草项下收载方法[4]，同时对流动相系统进行了摸索，对乙腈-醋酸系统及甲醇-醋酸系统分别考察，发现甲醇-醋酸系统更有利于甘草酸与其他成分的分离。

十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片供试品溶液制备中，比较了超声提取和回流提取不同的提取方式，结果超声提取效果较好。根据甘草酸的性质，比较了70%乙醇、50%乙醇、甲醇超声提取对甘草酸提取率的影响，结果表明70%乙醇超声提取所得甘草酸的提取率最高。比较了超声提取30、40、50、60 min对甘草酸提取率的影响，结果表明十全大补丸和银翘解毒片提取40 min已基本提取完全，补中益气丸提取50 min已基本提取完全，故确定十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片提取时间分别为40、50、40 min。比较了以70%乙醇为提取溶剂、用量为25、50、75 mL对甘草提取率的影响，结果表明，溶剂用量为50 mL时已经提取完全。

取甘草酸铵对照品，加70%乙醇溶解，注入液相色谱仪，用二极管阵列检测器进行紫外全波长扫描（200～400 nm）。结果表明，甘草酸在254 nm附近有最大吸收峰，且样品空白无干扰，故选择254 nm作为检测波长。

按进口方卫生署要求，含甘草成分的产品甘草酸每日服用量不应超过100 mg，按日服剂量折算每1 g供试品中含甘草酸的限量。十全大补丸和补中益气丸每1 g含炙甘草以甘草酸计不得多于5.5 mg，银翘解毒片每1 g含甘草以甘草酸计不得多于15 mg。十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片经多批次检测所含甘草酸均未超出规定的日服用限量。

本试验建立的十全大补丸、补中益气丸、银翘解毒片中甘草酸含量测定方法准确、灵敏、快速、专属性强，所建立的甘草酸含量测定方法中供试品溶液制备方法操作简便，色谱条件相同，便于今后的生产检验，提高工作效率，降低检验成本。该方法可有效控制本品质量，提高该品种的可控性，保证产品疗效，提高药品的安全性。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2010：80.

[2] 王玉巧,王健斌,赵一玫,等.复方止咳颗粒中甘草酸含量测定方法学研究[J].中国药事,2001,25(2)：169-170.

[3] 吴迪,李艳,曾宪仪,等.高效液相色谱法测定安嗽胶囊中甘草酸的含量[J].中药新药与临床药理,2011,22(1)：94-96.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化学工业出版社,2005：59.

Content Determination of Glycyrrhizic Acid in Shiquan Dabu Pills, Buzhong Yiqi Pills,Yinqiao Jiedu Tablets by HPLC

WU Lin, YANG Guang, DU Jing, LIU Ying
(Beijing Tongrentang Technologies Co. Ltd. Pharmaceutical Factory, Beijing 100079, China)

Objective To establish content determination method of glycyrrhizic acid in Shiquan Ddabu Pills, Buzhong Yiqi Pills and Yinqiao Jiedu Tablets. Methods HPLC method was used to determine the content of glycyrrhizic acid in the three preparations. Zorbax SB C18column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; Methanol-2.5% Acetic acid (65∶35) was set as the mobile phase at flow rate of 0.8 mL/min; the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range of glycyrrhizic acid was in the range of 0.180 3–3.605 4 μg (r=1). The average recovery was 99.85% (n=6) in Shiquan Dabu Pills, 100.70% (n=6) in Buzhong Yiqi Pills, and 100.81% (n=6) in Yinqiao Jiedu Tablets. Conclusion The method is specific, simple and can be used to determine glycyrrhizic acid in the products containting glycyrrhizae.

Shiquan Dabu Pills; Buzhong Yiqi Pills; Yinqiao Jiedu Tablets; glycyrrhizic acid; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.024

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0099-04

（2015-10-09）

（2015-10-30；编辑：陈静）