ERCC1 mRNA表达水平与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步放化疗疗效相关性的临床研究

陈绍俊，吴梦馨，韦晓谋，黄海欣，尹 平

(1.华中科技大学同济医学院公共卫生学院，湖北 武汉 430022;2.广西医科大学第四附属医院肿瘤科，广西 柳州 545005；3.上饶市人民医院肿瘤科，江西 上饶 334000；4.广西医科大学第四附属医院肿瘤分子实验室，广西 柳州 545005)



ERCC1 mRNA表达水平与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步放化疗疗效相关性的临床研究

陈绍俊1,2，吴梦馨3，韦晓谋4，黄海欣1，尹 平2

(1.华中科技大学同济医学院公共卫生学院，湖北 武汉 430022;2.广西医科大学第四附属医院肿瘤科，广西 柳州 545005；3.上饶市人民医院肿瘤科，江西 上饶 334000；4.广西医科大学第四附属医院肿瘤分子实验室，广西 柳州 545005)

目的 探讨鼻咽癌组织中DNA切除修复交叉互补基因1(ERCC1)的mRNA表达水平与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步放化疗疗效关系。方法 78例初诊经鼻咽肿物活检确诊为鼻咽部低分化鳞癌的Ⅱ期鼻咽癌患者,取患者化疗前肿瘤组织通过RT-PCR方法检测其ERCC1 mRNA表达水平，患者均接受顺铂同步放化疗。通过RECIST 1.1实体瘤疗效评定标准评定近期疗效，分析ERCC1 mRNA表达水平与近期疗效的关系。结果 78例患者均可评价疗效，有效率为89.74%，疾病控制率为94.87%。Ⅱ期鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA的中位数水平为1.119。化疗前Ⅱ期鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA的表达水平与治疗后的近期疗效有显著相关性(P<0.05)。结论 ERCC1 mRNA表达水平对Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步化疗疗效及预后有一定的预测价值。

DNA切除修复交叉互补基因1；Ⅱ期鼻咽癌；顺铂

DNA切除修复交叉互补组1(excision repair cross-complementing group1, ERCC1)是核苷酸切除修复途径中重要成分，通过修复铂类-DNA复合物的切除影响铂类药物疗效。ERCC1的表达在预测患者铂类化疗疗效方面有一定的价值，但报道的均以免疫组化表达居多，鼻咽癌组织中的mRNA表达及相关性目前报道甚少，本研究通过RT-PCR法对化疗前鼻咽癌组织中ERCCl mRNA的水平进行测定，分析ERCC1 mRNA的表达与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步化疗疗效的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集广西医科大学第四附属医院肿瘤科及区内多家三甲医院2007年6月至2015年6月经鼻咽部活检确诊为鼻咽部低分化鳞状细胞癌的患者共78例，男60例，女18例；年龄15～73岁，中位年龄46岁。按AJCC第7版鼻咽癌分期标准：T120例，T258例；N020例，N158例；M078例。所有患者均符合以下条件:1)预期生存期>6个月;2)体力评分0～2分;3)中性粒细胞≥1.5×109·L-1，血小板≥100×109·L-1，血肌酐<12 mg·L-1，总胆红素、ALT、AST及AKP≤2.5倍正常参考值上限，均可评价近期疗效。

1.2 治疗方法 所有患者均接受顺铂同步放化疗的治疗模式。化疗方案为顺铂(江苏豪森药业集团有限公司，批号：20040813)80 mg·m-2静脉滴注，放疗于d1、d22、d43进行。放疗采用6 MV直线加速器，调强放疗，常规分割照射，5次/周，具体剂量：PGTVnx 70.06 Gy/31次、PGTVnd 70.06 Gy/31次，PTV1 66.03 Gy/31次、PTV2 54.25 Gy/31次。

1.3 检测方法

1.3.1 鼻咽癌组织中的RNA提取及检测 取100 mg鼻咽癌组织按照Trizol RNA提取液试剂盒说明书的方法抽提组织RNA。将提取出的RNA溶液保存于-80 ℃冰箱备用。以琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA的纯度及完整性。

1.3.2 基因组cDNA合成及PCR扩增 逆转录cDNA：使用日本Takara公司逆转录试剂盒。首先去除基因组DNA：取总RNA 1 μg，加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、最后补足无RNA酶水至10 μL。室温放置30 min。逆转录：取去除基因组后的总RNA 10 μL，加入 Prime Script RT Enzyme MIX 1.0 μL、RT Prime MIX 1.0 μL、5×Prime Script r Buffer 2 4.0 μL加水至20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s、4 ℃保存。PCR扩增：ERCC1引物及扩增条件：由日本Takara公司设计合成，使用Primer Premier 软件设计。ERCC1引物：上游引物：CCGCCAGCAAGGAAGAAA；下游引物：CTGCCGAGGGCTCACAAT，产物长度为278 bp。GAPDH上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGT；下游引物:CTTCCACGATACCAAAGTTGT，产物长279 bp。使用日本Takara公司试剂，取Ex Taq Version 2.0 plus dye 12.5 μL，加入cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL，最后补足水至25 μL。用美国ABI公司PCR仪将目的基因ERCC1和内参基因GAPDH同时扩增。扩增条件：98 ℃ 5 s，54.5 ℃ 45 s，共35个循环，72 ℃延伸后置4 ℃保存。产物在质量分数2%琼脂糖凝胶上(含1‰ gelred染料)以100 V电压直流电泳1 h，在美国BIO-RAD公司凝胶成像仪上扫描定量ERCC1及GAPDH的光密度积分值，并以ERCCl与GAPDH比值表示mRNA相对表达量。

1.3.3 疗效评价及生存记录 采用鼻咽部MRI影像学检查方法作为疗效评价标准，参照RECIST 1.1版标准评价：所有已知病灶消失并保持4周以上，定义为完全缓解(CR)；肿瘤最大单径之和减少30%以上，并保持4周以上，定义为部分缓解(PR)；肿瘤最大单径之和减少不超过30%或增加不超过20%，并保持4周以上，定义为病情稳定(SD)；肿瘤最大单径之和增加20%以上或出现新病灶，定义为疾病进展(PD)，以CR+PR计算有效率，以CR+PR+SD计算疾病控制率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 近期疗效 全组78例患者均可评价近期疗效，CR 51例(65.38%)，PR 19例(24.36%)，SD 4例(5.13%)，PD 4例(5.13%)，有效率为89.74%，疾病控制率为94.87%。

2.2 ERCC1 mRNA RT-PCR结果 78例鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA水平0.456～1.412，中位值为1.119。

2.3 鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系 根据ERCC1 mRNA表达的中位值水平将>中位值水平视为高表达，≤中位值水平视为低表达，78例患者的鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA的表达与患者的年龄、性别、T分期、N分期、M分期无关。见表1。

表1 鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系

2.4 ERCC1 mRNA表达水平与Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步放化疗疗效的关系 ERCC1低表达组41例中，CR 31例，PR 9例，SD 1例，PD 0例，有效率为97.56%，ERCC1 mRNA高表达组37例中，CR 20例，PR 10例，SD 3例 PD 4例，有效率81.08%，2组有效率比较差异有统计学意义(P=0.043)。化疗有效组的ERCC1 mRNA相对表达量中位值为1.110，而化疗无效组为1.140。

3 讨论

鼻咽癌的治疗以放疗为主，在初诊患者中，T2N0～1M0或T1N1M0的Ⅱ期鼻咽癌占据了一定的比例，然而，国内外对于Ⅱ期鼻咽癌如何治疗没有统一的定论，由于Ⅱ期鼻咽癌国内外的Ⅱ期临床研究并不多,Ⅲ期临床研究有限,至今缺乏充足的循证医学证据支持应采用何种建议。对于Ⅱ期鼻咽癌，美国NCCN诊疗指南把其归类为局部区域晚期鼻咽癌，推荐按局部区域晚期鼻咽癌治疗模式采用同步放化疗+辅助化疗。

在鼻咽癌的治疗模式中，目前大部份研究报道表明在包括鼻咽癌的头颈部肿瘤治疗中使用含铂类的同步放化疗方案可取得较好的疗效，大样本量的Meta分析已证实了同步放化疗在生存方面的优势。在循证医学的指导下，含铂类的同步放化疗方案为当前局部区域晚期鼻咽癌治疗的标准手段，其对总生存率及无进展生存率的显著提高得到了公认[1-2]。然而,临床上有相当一部分局部区域晚期鼻咽癌患者并不能从以铂类为基础的同步化疗中获益[3-5]。

ERCC1是一段长约15 kb的修复基因，定位于人类染色体 19q13.2～q13.3上，ERCC1基因在核苷酸的切除修复途径中发挥重要作用，可修复受损的DNA。是DNA修复NER途径中关键基因，ERCC1具有修复损伤DNA5′的识别功能，而且具有核酸内切酶的活性[6]。铂类药物的主要作用机制是与DNA上的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶结合形成Pt-DNA加合物，导致DNA的链间交联或链内交联，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡[7]。而ERCC1本身基因的核苷酸序列异常会影响ERCC1 mRNA和其蛋白水平的表达，使得个体对铂类药物的敏感性会产生差异，影响铂类药物疗效。ERCC1的高表达可使停滞在G2/M期的损伤DNA出现迅速修复，导致其可能对铂类药物耐药。既往众多文献报道ERCC1和铂类药物的敏感性有密不可分的关系，大部分研究均认为ERCC1在非小细胞肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中的表达水平可以成为预测铂类药物化疗效果的指标，并与疾病无进展生存期及总生存期均有关[6-12]。研究涉及非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤，但有关ERCC1表达与鼻咽癌顺铂同步放化疗敏感性关系的研究国内报道较少，曹轶林等[13]报道了晚期鼻咽癌患者肿瘤组织中ERCC1的蛋白表达水平似乎与以铂类为基础化疗的敏感性密切相关，也许可作为化疗效果预测因子，但ERCC1的mRNA表达水平与鼻咽癌的相关性至今未见报道。

本研究检测了ERCC1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达情况,并预测其可否指导铂类药物在鼻咽癌治疗中的使用。研究结果显示，在鼻咽癌组织中ERCC1 mRNA是存在表达的，其表达水平0.456～1.412，中位值为1.119。ERCC1 mRNA高表达组有效率81.08%(30/37)，低于ERCC1低表达组的97.56%(40/41)；化疗有效组的ERCC1 mRNA相对表达量中位值为1.11，低于化疗无效组的1.14。我们考虑ERCC1 mRNA的表达水平在鼻咽癌组织中可能可以作为铂类化疗疗效的预测指标。

总之，ERCC1 mRNA表达水平对Ⅱ期鼻咽癌顺铂同步化疗疗效及预后有一定的预测价值，但是鉴于目前化疗分子标志物的检测的结果不尽如人意，我们认为需要扩大样本量，开展大规模的Ⅲ期临床实验及细胞分子实验深入研究进一步证实明确。

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Relationship Between Expression of ERCC1 mRNA and Effect of Cisplatin Concurrent Radiochemotherapy for Stage Ⅱ Nasopharyngeal Carcinoma

Chen Shaojun1,2, Wu Mengxin3, Wei Xiaomou4, Huang Haixin1, Yin Ping2

(1.SchoolofPublicHealth,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China;2.DepartmentofOncology,theFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005,China;3.DepartmentofOncology,thePeople’sHospitalofShangrao,Shangrao334000,China;4.TumorMolecularLaboratory,theFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005)

Objective To investigate the relationship between the expression of excision repair cross-complementing gene 1 (ERCC1) mRNA of stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma and effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for nasopharyngeal carcinoma.Methods RT-PCR method was used to detect the expression of ERCC1 in 78 patients with stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma before treatment, and all the 78 patients were treated with cisplatin concurrent radiochemotherapy. The short-term effect was evaluated by RECIST 1.1 solid tumors evaluation criteria, and the relationship between the expression of ERCC1 mRNA and effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma was analyzed.Results Of all the 78 patients, the effective rate was 89.74%, the disease control rate was 94.87%. The median of ERCC1 mRNA expression levels was 1.119. The expression of ERCC1 mRNA was positively related with effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for nasopharyngeal carcinoma.Conclusion The predictive value of expression of ERCC1 mRNA is clear for efficacy of cisplatin chemotherapy in the treatment of stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma.

excision repair cross-complementing gene 1; stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma; cisplatin

广西自然科学基金面上项目(编号：2011GXNSFA018236)；柳州市重大项目(编号：2014J030404 )

陈绍俊(1979-)，女，硕士，教授，主任医师，主要从事肿瘤的综合治疗工作。E-mail:chenshaojun388@163.com

尹平(1965-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物统计学方法与应用研究。E-mail：ping_y2000@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.002

R739.63；R730.58

A

1673-5412(2016)05-00373-04

2016-07-22)