莲瓣兰大雪素FT基因克隆和系统发育分析

， ， 银河， (.云南农业大学农学与生物技术学院和工程中心, 昆明 65020;2.昆明市官渡区第五中学， 云南 昆明 6500)

莲瓣兰大雪素FT基因克隆和系统发育分析

何卫1,2，赵靓1，赵银河1，王云月1
(1.云南农业大学农学与生物技术学院和工程中心, 昆明 650201;2.昆明市官渡区第五中学， 云南 昆明 650011)

控制植物开花的途径有光周期现象、GA、春化途径、自主途径，在光周期途径中，CO基因促进开花通过直接上调FT和SOC1基因表达，FT(FLOWERINGLOCUST)是光周期途径植物开花时间决定关键基因，并认为FT基因表达产物可能就是长期追寻的开花刺激物质，这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输，最终引起茎顶端花器官分化的起始。本研究以莲瓣兰大雪素作为实验材料，用RACE方法快速地克隆全长cDNA，生物信息学分析全长cDNA为662 bp，含有编码框和3′UTR,具有完整的开放阅读框 (ORF) 522 bp,编码173氨基酸的蛋白质。通过系统发育分析获得一个FT同源基因。本研究为进一步对这个基因的功能研究奠定了基础。

植物花器官； 莲瓣兰大雪素；FT基因克隆； 系统发育

植物完整的生命周期分为营养生长和生殖生长2个阶段，其中由营养生长向生殖生长转换的过程称为开花诱导。高等植物的开花过程受内因和外因2方面决定，是开花基因在时空表达的结果[1]。开花相关基因的表达则是实现由营养生长向生殖生长转变的基础，环境因子以及细胞自身的生长状况对这些基因的表达起着调控作用。在众多的外界环境(如温度，光照等)中，植物开花尤其对光周期信号非常敏感，并对其作出适应性反应。目前已了解到光周期信号被植物成熟叶片接收和感知并产生开花刺激物质，这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输，最终引起茎顶端开花起始。FT(FLOWERINGLOCUST)是光周期途径植物开花时间决定关键基因，并认为FT基因的表达产物FT蛋白可能就是人们长期追寻的开花刺激物质，即开花素(florigen)[2-3]。

FT基因是植物开花的诱导因子。植物的开花时间受到光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自发途径的调控，并通过FT将以上4种途径所感知的信号整合。FT促进植物从营养生长到生殖生长的转变，是促进开花的信号整合因子。在光周期调控途径中，光受体接收外界光信号后，经过生物钟基因将光信号传递到CO(CONSTANS)，在长日照条件下CO诱导下游基因FT表达，FT蛋白在茎端分生组织中与FD(FLOWERINGLOCUSD)蛋白结合促进AP1(APETALA1)的表达。AP1是花发育的早期标记基因，它的表达意味着花发育的开始。

FT基因编码的蛋白可能是开花素的组分之一。Knott早在1934年就注意到叶片感知光周期的信号，而花的形成则在植株顶端，由此推测经光周期诱导后的叶片中必定有信号物质长距离运输至茎端，导致顶端分生组织形成花器官。1937年，Chailakhyan明确提出开花素的概念，认为开花素是在适宜光周期下形成的特异性促进开花的激素类物质。在此后的70年里，开花素的研究一直未取得突破。近年来，在拟南芥等植物光周期途径的分子生物学研究中发现，FT基因与开花素有关。现有的实验结果表明，CO诱导FT在叶片的韧皮部表达，FT蛋白经韧皮部的伴胞运输到植株顶端，与FD相互作用促进花分生组织特征基因AP1的表达，引起植株开花，FT蛋白是可以运输的花诱导信号，由此推测FT蛋白是开花素的组分之一[4]。

FT基因是在模式植物拟南芥中克隆得到，FT蛋白是开花素的主要成分，控制着拟南芥等植物的开花时间。目前，已经在水稻、小麦、葫芦、番茄、柑橘等其他植物中克隆出了FT的同源基因，并对部分植物进行了遗传转化，转基因植物中FT类基因的过量表达均不同程度地引起了转基因植株的早期开花[5]。已有的研究表明，在不同植物中，FT基因的表达和功能具有一定的差异，但是均具有促进植物开花的作用，这表明不同植物中FT基因的功能有很大的保守性。

莲瓣兰(Cymbidiumtortisepalum)是中国春兰的一个新品系，亦称小雪兰。大雪素是莲瓣兰中较为常见的一种，滇兰四大名品之首，于春节前后开花，已有数百年的栽培历史，原产于滇西的部分地区[6]。本研究以莲瓣兰大雪素做实验材料，用RACE方法快速地克隆全长cDNA ，从花的器官材料中分离开花相关FT基因并进行克隆。通过对莲瓣兰大雪素FT基因的初步研究，了解FT基因在开花调控中的作用。

在兰花中FT基因的研究还缺乏，本研究是通过RACE方法，克隆出全长cDNA，进一步通过系统发育分析从莲瓣兰大雪素中获得与兰花开花相关的FT基因。因此，从莲瓣兰大雪素分离与开花时间有关的FT基因，研究其在促进莲瓣兰大雪素开花过程中的作用是非常必要的，这对阐明莲瓣兰大雪素开花机制有一定的理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料为莲瓣兰大雪素(Cymbidiumtortisepalum)，主产于滇西[7]。它盛开在元旦春节期间，花枝高挺出架，花朵洁白，具有暗香。

1.2 必要培养液的配置

200 mL LB培养液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl(pH=7)，若配制固体培养基则加3 g琼脂。

1.3 实验设备

计算机、PCR仪、电泳槽、离心机、振荡床、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、灭菌锅、烘箱、移液设备、容器、刮子等。

1.4 RNA的提取

选用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取大雪素花器官的RNA，严格按照试剂盒进行。

1.5 特异性引物设计

3′-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

FT-F 5-TTCACTTAAATTCTCTCCAGCC-3

FT-R 5-CTATCTGAATAATTAAAAGACCTTG-3

1.6 cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程进行。3’SMART-RACE PCR加入以下试剂于灭菌的PCR反应管中：Total RNA, 2μg；10×Advantage PCR Buffer,5μL;dNTP mix(10 mmol/L), 4μL;Primers (10μmol/L),各0.75μL; Advantage 2 Polymerase Mix,2μL;ddH2O 17.75μL。混合以上试剂，短暂离心，将反应管放在预热的PCR仪上，按下列程序进行循环：

35的循环；94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,55 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞。

循环结束后，取5μL 样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测合成情况。

1.7 电泳检测，割胶回收目的片段

取5μL的PCR产物进行克隆，克隆方法参照文献[8]，随机筛选白色菌落，送北京华大基因公司进行测序。

图1 FT 基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列

1.8 序列比对和系统发育树的构建

用Blast在NCBI中搜索，利用CLUSTAL-x和MEGA-5软件进行分析[9-10]。

2 结果与分析

2.1 RACE克隆莲瓣兰大雪素(Cymbidium tortisepalum)FT基因的全长

用转录组测序方法获得了FT基因的序列,在NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/database中进行功能预测是FT的 5′端序列。为了进一步研究这些基因的功能及表达特性，克隆了全长序列cDNA。对莲瓣兰大雪素不同发育时期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合样品进行Total RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳方法监测RNA的质量；以Total RNA为模板，按照RACE试剂盒的说明进行反转录后得到3′端和5′端cDNA模板, 对3′端的cDNA模板进行特异引物和Outprimer进行PCR扩增，获得3′端片段，然后5′端与3′ 端的序列进行拼接，在5′和3′端设计特异引物，再一次进行全长cDNA的克隆，对菌液PCR进行进一步的测序，获得了这个基因的全长cDNA。这个基因cDNA 全长为 662 bp, 包含1个长为34 bp的5′UTR和103 bp的3′UTR非翻译区，具有完整的开放阅读框 (ORF) 522 bp, 编码173氨基酸的蛋白质，如图1。从莲瓣兰大雪素中分离出来的FT基因。

2.2 蛋白质结构域和系统发育分析

用ClastalX[9]对从莲瓣兰大雪素中克隆的FT基因与GenBank下载的有关FT的蛋白质序列进行对齐，从莲瓣兰大雪素中分离出来与促进植物开花的基因FTcDNA全长为662 bp，包含有编码框和3′UTR,具有完整的开放阅读框 (ORF) 522 bp, 编码173氨基酸的蛋白质从蛋白质的结构分析发现与其他的FT基因一样，在其第2个外显子的85位上的氨基酸为保守的酪氨酸，是对于FT的激活时必要的；另外还有一个非常重要的蛋白质结构域是具有14个氨基酸的P-loop domain,这2个重要的结构域是PEBP蛋白家族很普遍(如图2)。

从全长FTcDNA序列和蛋白质，与其它已经基因进行基因序列和蛋白质进行系统树的构建，对开花起重要作用的基因家族之间的进化关系进行分析。分别用Maximum likelihood (ML) tree构建的系统树分析的结果。用ClastalX[8]对在莲瓣兰大雪素克隆的FT基因与GenBank下载的有关的FT的蛋白质序列进行对齐，以及用 MEGA version 5.0[10]对齐输出。A Maximum Likelihood (ML) tree方法构建树。在P-distance model下估计遗传距离。ML树的构建来自500 bootstrap replicates。用ML法对来自于莲瓣兰大雪素的FT基因进行系统树的构建，从图3可看出，莲瓣兰大雪素的FT基因与从大豆和小果野蕉中分类出来的FT基因聚为一枝,支持率为67%，但并不与来自于兰科的FT蛋白聚为一枝，从莲瓣兰大雪素中分离出来的FT基因并没有与其他兰花中分离出来的基因具有支持率(图3)。

图2 FT蛋白质结构域的比较

图3 FT 基因的进化分析

3 讨 论

本实验以莲瓣兰大雪素作为材料，分离出FT基因，通过RACE方法快速克隆出全长cDNA，获得全长约为662 bp的cDNA，通过测序分析，确定该基因为522 bp的全长cDNA序列，共编码173个氨基酸。将获得的序列及其推导的氨基酸序列在NCBI上进行Blastx分析,发现该基因为编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的基因家族成员中的FT，并具有极高的保守性。

PEBP在进化上相当保守的蛋白家族，但许多基因的功能还不清楚。一般认为PEBP家族基因是植物开花的主要调节者[10]。PEBP家族基因由FT-LIKE、MFT-LIKE、TFL-LIKE 3个亚家族组成，FT基因属于其中的FT-LIKE亚家族。

从营养生长到生殖生长的成花转变是植物适应外界环境，确保物种和个体繁衍的关键环节。成花转变的时间受内部和外部环境信号的调控。在各种环境信号中，光周期信号可促使植物在最适季节开花。在光周期途径中，对光和昼夜的反应最终导致CO基因的激活，CO基因进一步激活叶片中的FT基因，FT蛋白通过韧皮部进行长距离运输，从叶片中达到植物的顶端分生组织，再在顶端分生组织与FT结合，进一步激活下游的基因，从而控制开花。

控制开花的途径除光周期外，还有春化、GA、自主调节途径。这些开花调控途径间彼此相互作用，构成错综复杂的调控网络，但它们最终汇集于被称为“开花整合因子”的开花调控基因FT、SOC1 (SUPPRESSOROFOVEREX-PRESSIONOFCO1)和LFY(LEAFY)。其中，FT的表达除受光周期途径的调控外，还部分地受春化和自主途径的调控，表明FT是一植物开花调控途径的重要整合因子。

FT是光周期途径促进开花的关键基因，已有很多植物中分离和克隆了FT基因并进行了研究，如长日照植物拟南芥、金鱼草等，短日照植物水稻、大豆等，日中性植物番茄等，并通过转基因证明FT基因的表达可促进植物提早开花，并发现FT家族基因的结构和功能在不同物种间存在着高度的保守性[11-12]。FT基因的研究已取得了很大的进展，但仍然存在很多问题有待深入研究。例如，开花素基因FT蛋白是如何完好无损地从叶片传输到顶端分生组织的；同一植物体内同时存在多个拷贝FT同源基因时，它们之间如何协同合作等问题。所有问题若能得到解决，将不仅有助于深入了解FT基因控制植物开花时间的分子机制，而且对通过转基因技术进行观赏植物花期调控具有重要的理论指导意义。

[1]张婧. 高等植物开花基因FT研究进展[J].现代农业科技,2012(3):12

[2]贾贞,赵菲佚,吴存祥.FT及其同源基因在植物发育调控中的多功能效应[J].西北植物学报,2011,31(12):2 558-2 564.

[3]郭春晓,田素波,郑成淑,等.光周期途径植物开花决定关键基因FT[J].基因组学与应用生物学,2009,28(3):613-618.

[4]Wigge PA,Kim MC,Jaeger KE,et al.Integration of spatial and temporal information during floral induction inArabidopsis[J].Science,2005,309(5 737):1 056-1 059.

[5]贾小明,张焕玲.3种FT基因诱导杨树早期开花比较[J].东北林业大学学报,2011,39(11):1-4.

[6]陈贵.云南名兰大、小雪素[J].中国花卉园艺,2001(17):45.

[7]赵银河,彭晟,周平,等.莲瓣兰大雪素SOC1基因克隆和系统发育分析[J].种子,2015,34(5):1-5.

[8]Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,et al.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997,25:4 876-4 882.

[9]Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al.MEGA 5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol,2011,28:2 731-2 739.

[10]孙洪波,贾贞,韩天富.PEBP家族基因在植物发育调控中的作用[J].植物生理学通讯,2009,45(8):739-747.

[11]Expression of aFLOWERINGLOCUSThomologue is temporally associated with annual flower bud initiation inEucalyptusglobulussubsp.globulus(Myrtaceae)[J].Australian Journal of Botany,2011,59:756-769.

[12]Igasaki T,Watanabe Y,Nishiguchi M,et al.The FLOWERING LOCUS T/TERMINAL FLOWER 1 Family in Lombardy Poplar[J].Plant Cell Physiol,2008,49(3):291-300.

Isolation and Phylogenetic Analysis of aFTGene fromCymbidiumtortisepalum

HEWei1,2,ZHAOJing1,ZHAOYinhe1,WANGYunyue1
(1.College of Agronomy and Biotechnology and Engineering Center，Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Guandu No.5 High School of Kunming,Kunming Yunnan 650011,China)

There are photoperiod, GA, vernalization, and independent pathways to control plant flowering.COgene promotes flowering through regulatingFT(FLOWERINGLOCUST)andSOC1(SUPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1) genes expression directly in the photoperiod pathway.FTis considered that it is a key gene to regulate flowering time in pathway,and its expression productions are flowering stimulating substances for a long time.The kind of flowering stimulating substances transport from leaves to the top of stems,and ultimately causes flowering.Using rapid amplification of cDNA ends (RACE),FTgene was cloned quickly.Bioinformatics analysis showed that the full length was 662 bp,with the open reading frame (ORF) of this gene was 522 bp，encoding 173 amino acids.We obtained theFTgene fromCymbidiumtortisepalumwith phylogenetic analysis.It is the basic for further study of this gene function.

floral organ；Cymbidiumtortisepalum；FTgene clone； phylogenetic analysis

2016-04-11

国家自然科学基金(编号：NSFC 31060166 and NSFC 31460053)和云南省中青年学术技术带头人后备人才基金(编号：2012 HB 018)资助。

何 卫(1981—)，男，博士研究生，主要从事植物学遗传学研究。

赵银河(1967—)，女，副教授，遗传学博士，主要从事发育生物学研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.009

S 682.31

A

1001-4705(2016)08-0009-05