RP—HPLC同时测定不同产地太白贝母中9种核苷类成分的含量

罗静 张华 张德全 杨丝丝 周浓

摘要：目的 建立反相高效液相色谱法同时测定不同产地太白贝母中9种核苷类成分（尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷）含量的方法，并比较不同产地太白贝母中核苷类成分含量。方法 采用Venusil MP C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，柱温35 ℃。结果 尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷的线性范围分别为0.269 5～16.17 ?g/mL、0.132 1～7.927 5 ?g/mL、0.095 5～5.73 ?g/mL、1.16～69.6 ?g/mL、0.48～28.8 ?g/mL、0.571 5～57.15 ?g/mL、0.526～52.6 ?g/mL、3.307 5～198.45 ?g/mL、0.530 5～31.83 ?g/mL，r≥0.999 5；加样回收率为96.49%～101.65%（RSD≤2.92%）。结论 不同产地太白贝母中9种核苷类成分含量存在差异，栽培品和多年生野生品均以重庆市城口县咸宜乡样品含量最高。本研究建立的方法可为太白贝母质量标准的完善提供依据。

关键词：太白贝母；反相高效液相色谱法；水溶性成分；核苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.025

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0106-04

Simultaneous Determination of Nine Nucleosides in Fritillaria taipaiensis P. Y. Li from Different Producing Areas by RP-HPLC LUO Jing1， ZHANG Hua2， ZHANG De-quan3， YANG Si-si2， ZHOU Nong2，3 （1. Chongqing Institute for Food and Drug Control， Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control， Chongqing 401121， China； 2. College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404000， China； 3. College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China）

Abstract： Objective To develop a sensitive and reliable RP-HPLC method for the simultaneous determination of nine nucleosides including uracil， cytidine， guanine， uridine， adenine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine from Fritillaria taipaiensis P. Y. Li that had been cultivated in different producing areas； To compare the contents of these nucleosides from different producing areas. Methods The analysis was performed on a Venusil MP C18 （2） column （4.6 mm×250 mm， 5 ?m） with a gradient of methanol-water at a flow rate of 1.0 mL/min； the detective wavelength was set at 260 nm； the column temperature was set at 35 ℃. Results Uracil， cytidine， guanine， uridine， adenine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine were obtained in the good linear range of 0.269 5–16.17 ?g/mL， 0.132 1–7.927 5 ?g/mL， 0.095 5–5.73 ?g/mL， 1.16–69.6 ?g/mL， 0.48–28.8 ?g/mL， 0.571 5–57.15 ?g/mL， 0.526–52.6 ?g/mL， 3.307 5–198.45 ?g/mL， 0.530 5–31.83 ?g/mL， respectively （r≥0.999 5）； the recovery was in the range of 96.49%–101.65% （RSD≤2.92%）. Conclusion The contents of the nine nucleosides from different producing areas have differences. Fritillaria taipaiensis P. Y. Li from Xianyi Village， Chengkou County， Chongqing City， whether the cultivated ones or wild ones， contain the highest level of nucleosides. The established method can provide references for the perfection of quality standard for Fritillaria taipaiensis P. Y. Li.

Key words： Fritillaria taipaiensis P. Y. Li； RP-HPLC； water-soluble components； nucleosides

太白贝母为2015年版《中华人民共和国药典》川贝母项下品种之一，为百合科贝母属太白贝母Fritillaria taipaiensis P. Y. Li的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效[1]。据文献记载，太白贝母在民间作为川贝母使用有着悠久的药用历史，并被四川、甘肃、宁夏等多地中药材标准收载作川贝母使用[2]。

太白贝母的主要活性成分为生物碱、皂苷、水溶性成分等[3]，贝母的水溶性成分具有抗炎、抑制血小板凝聚、降压、松弛平滑肌等作用[4-5]。贝母的水溶性活性成分主要为核苷类[6-7]，现有研究多针对核苷类成分进行含量测定[6-9]。本研究对太白贝母主产区（重庆市巫溪县、城口县和陕西太白县[10]）采集的14批不同产地样品进行9种核苷类成分的含量比较分析，考察不同产地间太白贝母核苷类成分的含量差异，以全面掌握太白贝母的资源状况，为贝母药材质量标准的提高提供依据，同时为筛选优势种质资源提高人工栽培质量以实现太白贝母野生药材保护和资源可持续发展奠定基础。

1 仪器与试药

Waters 2695 HPLC仪，包括真空在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器和Empower工作站（美国Waters）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SARTORIUS BP221S型电子天平（德国赛多利斯），METTLER TOLEDO Ax205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

14批不同生长年限太白贝母样品于2013年6月间分别采自重庆市、陕西省的不同地区，经重庆三峡学院周浓副教授鉴定为百合科植物太白贝母Fritillaria taipaiensis P. Y. Li的干燥鳞茎。尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为100469-200401、140631- 201205、110887-200202、886-200001、101215-201401、110879-200202），胞苷、鸟苷、2'-脱氧腺苷对照品（南京都莱生物技术有限公司，经HPLC峰面积归一化法计算纯度>98%）。甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；以甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱程序见表1；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 ?L。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取上述9种核苷类对照品适量，加水制成每1 mL含尿嘧啶107.8 ?g、胞苷52.85 ?g、鸟嘌呤38.2 ?g、尿苷464.0 ?g、腺嘌呤96.0 ?g、鸟苷228.6 ?g、胸苷105.2 ?g、腺苷1323.0 ?g、2'-脱氧腺苷106.1 ?g的对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过3号筛）约1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加水10 mL，混匀，室温超声提取60 min（功率300 W，频率40 kHz），放至室温，4 000 r/min离心10 min，取上清液，用0. 45 ?m微孔滤膜过滤，即得。

2.4 系统适用性试验

按“2.1”项下色谱条件，各相邻色谱峰之间分离度均>1.5，理论塔板数均不低于5 000，对照品及供试品中9种核苷类成分基线分离，色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品贮备液适量，用水稀释成7个不同浓度的混合对照品溶液。按上述色谱条件进行测定，以峰面积对其浓度进行线性回归，建立回归方程，结果见表2。

2.6 精密度试验

取同一浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，记录峰面积，测得尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷RSD分别为0.64%、0.67%、1.95%、0.76%、0.97%、1.57%、0.82%、1.53%、1.12%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一产地样品（S9），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下测定9个核苷类成分含量，结果尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷RSD分别为1.98%、1.54%、2.96%、1.65%、2.50%、1.82%、2.75%、1.86%、2.32%，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液（S9），分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，结果尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷峰面积RSD分别为1.72%、1.16%、2.86%、2.10%、2.43%、1.51%、1.38%、2.66%、2.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的太白贝母样品（S9）共6份，每份约0.5 g，分别精密加入一定量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定含量，并计算回收率，结果见表3。

2.10 样品含量测定

取14批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC分析，测定峰面积，以外标两点法计算各产地样品中9种核苷类成分含量，结果见表4。

3 讨论

供试品溶液的制备比较了回流和超声2种方法，结果超声提取法提取率显著高于回流提取法；由于核苷类物质极性大，且尿嘧啶、尿苷等在有机溶剂中溶解性差，分别以纯水及不同浓度甲醇（5%、10%、20%、30%、50%）为提取溶剂，考察不同的提取时间（30、60、90、120 min）及提取溶剂用量（10、20、30倍），结果以10倍纯水为溶剂、超声60 min提取率最高；另外，试验比较了甲醇和乙腈洗脱，发现以甲醇-水梯度洗脱所得到色谱分离效果最佳。

本试验测定的14批太白贝母样品均含有尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷，其中以尿苷、鸟苷、腺苷含量相对较高，与黄氏等[6]对太白贝母水溶性成分研究结果一致，建议可增加尿苷、鸟苷、腺苷含量测定项以完善川贝母（太白贝母）质量控制。14批样品中，栽培品核苷类成分总含量水平整体上随生长年限增加而呈现先升后降的趋势，野生品总含量水平呈现随生长年限增加而减小的趋势，这与PENG等[8]研究结果一致，但栽培品中腺苷、鸟苷含量呈现随生长年限增加而增加的趋势，说明太白贝母不同生长年限对其不同种类核苷类成分的含量影响不同，有待进一步深入研究。太白贝母野生品中核苷类成分总含量水平高于栽培品，表明目前太白贝母的人工种植虽然已形成一定种植规模且有比较成熟的种植技术，但人工栽培技术还有待提高，还应加大种质资源库与人工抚育区建设。

总之，通过对14批不同产地太白贝母核苷类成分含量比较表明，重庆市城口县咸宜乡无论栽培品还是多年生野生品，其核苷类成分总含量皆为最高，提示可在该地种植太白贝母优良品种，建立太白贝母GAP生产基地，以满足临床用药和中成药生产需求。

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