左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响

孟盼 赵洪庆 杜青 王宇红 杨蕙 张秀丽 徐雅岚

1.湖南中医药大学，湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208；

2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

摘要：目的 观察左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠学习记忆能力以及海马JNK、Bcl-2、Bax表达的影响，探讨其对糖尿病并发抑郁症大鼠海马损伤的保护机制。方法 采用高脂饲料灌胃联合尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，继续给予28 d慢性应激建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。实验大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组及左归降糖解郁方高、中、低剂量组。末次给药后，采用Morris水迷宫测试大鼠逃避潜伏期时间，Western blot检测海马JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达；RT-PCR检测JNK、Bcl-2、Bax基因表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01），JNK、Bax蛋白及基因表达明显上升，Bcl-2表达明显下降（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），JNK、Bax蛋白及基因表达均明显下降，Bcl-2表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论 左归降糖解郁方能明显改善糖尿病并发抑郁症大鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与抑制海马神经元凋亡有关。

关键词：左归降糖解郁方；糖尿病并发抑郁症；神经元凋亡；JNK；Bcl-2；Bax；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0078-04

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on Hippocampal Neuronal Apoptosis in Diabetic Rats with Depression MENG Pan1， ZHAO Hong-qing1， DU Qing1， WANG Yu-hong1， YANG Hui2， ZHANG Xu-li1， XU Ya-lan1 （1. Hunan University of Chinese Medicine， Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula （ZJJF） on the ability of learning and memory and the expressions of JNK， Bcl-2 and Bax in hippocampus in diabetic rats with depression； To explore the protective mechanism of hippocampal damage in diabetic rats with depression. Methods High-fat gavage combined with intravenous injection of STZ was used to establish the model of diabetic rats. 28 days of chronic stress was given continuously and diabetic rats complicated with depression were built successfully. Then rats were randomly divided into 6 groups， including normal， model， positive medicine， high-， medium-， and low-dose of ZJJF groups. After the last administration， Morris water maze was used to detect escape latency time； Western blot was used to disclose the protein expressions of JNK， Bcl-2 and Bax in rat hippocampaus； RT-PCR was used to test the gene expressions of JNK and Bcl-2 and Bax. Results Compared with the normal group， escape latency time in model rats was significant longer （P<0.01）， the protein and gene expression of JNK and Bax in rat hippocampaus significantly increased， Bcl-2 was markedly decreased （P<0.05， P <0.01）； Compared with the model group， escape latency time in positive medicine group and high-dose of ZJJF group was significant shorter （P<0.01）， the protein and gene expressions of JNK and Bax significantly decreased， and Bcl-2 markedly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion ZJJF can significantly improve the ability of learning and memory in diabetic rats with depression， which might be associated with preventing neuronal apoptosis in hippocampus.

Key words： Zuogui Jiangtang Jieyu Formula； diabetes with depression； neuronal apoptosis； JNK； Bcl-2； Bax； rats

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为主要特征的代谢性疾病，易引发多种并发症。其中，糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）是其危害最大、自杀率最高的慢性并发症之一[1]。本课题组前期研究表明，DD发生发展的关键靶部位主要位于大脑海马区，表现为海马神经元萎缩、凋亡、可塑性降低[2-3]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，活化的JNK可以通过磷酸化作用直接调节Bcl-2家族成员，如B细胞淋巴瘤/Bcl-2、Bax等活性，从而介导线粒体途径的细胞凋亡[4]。左归降糖解郁方是以张仲景的左归饮、左归丸化裁而得的左归降糖方为基本方，加入化瘀行气、疏肝解郁的姜黄、贯叶连翘而得，全方共奏滋阴益气、化瘀解郁的功效。研究表明，其能明显改善DD大鼠的抑郁行为，并对海马损伤起到保护作用[5]。本实验采用Western blot和RT-PCR分别检测JNK、Bcl-2、Bax蛋白及基因的表达，探讨左归降糖解郁方对DD大鼠海马神经元凋亡的影响，为临床防治DD提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

7～8周龄雄性SD大鼠75只，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心，室温（25±1）℃、相对湿度（50±5）%。高脂乳剂配方：20%猪油、10%胆固醇、2%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶、20%吐温80、20%丙二醇。

1.2 药物

左归降糖解郁方由贯叶连翘、黄芪、姜黄、熟地黄、枸杞子、山萸肉、菟丝子、杜仲、牡丹皮、丹参、牛膝等组成，饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房。盐酸二甲双胍片，0.25 g/片，湖南湘雅制药公司，批号1402115；盐酸氟西汀胶囊，20 mg/粒，法国Patheon公司，批号2087A。

1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司；JNK、Bcl-2、Bax单克隆抗体，Abcam公司；NC膜，美国millipore公司；RIPA组织细胞快速裂解液，上海基尔顿生物科技有限公司；Trizol试剂，Life technolgies公司；SYBR MasterMix（Cat：CTB103）、反转录试剂盒（Cat：CTB101），江苏楚天生物科技有限公司。动物行为学习记忆系统（Viewpoint），DVP-W7显微镜图像处理系统（南京长城信息系统公司），5417R冷冻离心机（Eppendorf），GS-6R离心机（Beckman），Lightcycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche），Mini Protean 3 cell电泳仪、凝胶成像分析系统（Bio-Rad）。

2 实验方法

2.1 造模

75只正常大鼠按体质量随机分为2组，其中10只作为空白组，其余65只大鼠进行糖尿病造模。糖尿病模型制备方法为14 d高脂饲料（10 mg/kg）灌胃联合小剂量STZ（38 mg/kg）尾静脉注射，造模3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，测定空腹血糖。剔除造模过程中死亡的大鼠，选取空腹血糖≥16.00 mmol/L者作为糖尿病模型大鼠，按血糖值随机分为模型组、阳性药组和左归降糖解郁方高、中、低剂量组（简称中药高、中、低剂量组）。其中模型组与阳性药组各11只，其余3组各12只。继续给予糖尿病模型大鼠慢性不可预见性应激，应激方法包括4 ℃冰水浴、45 ℃热刺激、电击、倾笼、噪音、潮湿垫料、昼夜颠倒、夹尾，每日采用1种刺激，同种刺激不连续出现，连续28 d，期间大鼠均孤笼饲养[6]。

2.2 给药

实验用药均自行配制，取盐酸二甲双胍片8片和盐酸氟西汀胶囊1粒溶于111 mL蒸馏水即得所需阳性药物浓度，实验所需复方中药用所购饮片煮煎并浓缩至实验浓度，高、中、低剂量（32.82、16.41、8.20 g/kg）分别相当于原药材4.56、2.28、1.14 g/mL。各组大鼠于造模同时灌胃给药10 mL/kg，空白组和模型组给予等量蒸馏水。末次给药结束后大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，取脑，剥离海马，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫被均分为4个象限，平台置于西南象限水下2 cm。给药24 d后，对所有大鼠进行水迷宫训练，训练时大鼠从平台另侧面向池壁放入，2 min内找到平台则训练结束，未找到平台大鼠则将其引导至平台，停留数秒。连续训练4 d，于第5日进行水迷宫测试，记录大鼠逃避潜伏期。

2.4 Western blot检测JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达

取冷冻保存的海马组织，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上匀浆，离心取上清液制备组织蛋白提取液，保存待用。检测大鼠海马JNK、Bcl-2、Bax的表达量，以GAPDH为内参。应用Image J图像处理软件对条带进行扫描，测定灰度值，计算各组目的蛋白的相对表达量。

2.5 RT-PCR检测JNK、Bcl-2、Bax基因表达

取-80 ℃冷冻保存的海马组织，加入Trizol试剂，冰上匀浆，按RNA提取步骤提取海马组织总RNA，抽提总RNA，进行反转录。42 ℃、1 h， 75℃、5 min以合成cDNA。PCR反应扩增JNK、Bcl-2、Bax基因产物，反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，共45个循环。用2-??Ct法进行基因表达差异数据分析，?Ct=Ct目标基因-Ct参比基因，2-??C=2-?Ct（待测组样品基因）÷2-?Ct（对照组样品基因）。引物自行设计，深圳华大基因公司合成，见表1。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 左归降糖解郁方对模型大鼠逃避潜伏期的影响

与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）。结果见表2。

4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠海马JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马JNK、Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠海马JNK、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表3、图1。

4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠海马JNK、Bcl-2、Bax基因表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马JNK、Bax基因表达明显升高，Bcl-2表达明显下降（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠海马JNK、Bax基因表达降低，Bcl-2表达升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。

5 讨论

Morris水迷宫主要用于考察实验动物的空间学习记忆能力，广泛应用于与大脑海马组织病变相关的神经系统疾病研究。Morris水迷宫测试结果表明，与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，表明DD状态下大鼠空间学习记忆功能受到严重损害，予左归降糖解郁方干预后，其逃避潜伏期明显缩短，学习记忆能力得到改善。海马组织作为大脑边缘系统的关键组成部分，与学习记忆密切相关。本课题组前期研究表明，DD大鼠海马萎缩严重，神经元功能低下，胞体肿胀，内质网脱颗粒严重，线粒体内嵴消失[2，7]。因此我们推测，左归降糖解郁方改善DD大鼠学习记忆能力，可能与其保护海马组织损伤密切相关。

JNK能介导多种疾病引发的神经元凋亡，其能通过非转录依赖的方式直接调节胞质内靶蛋白Bax、Bcl-2等的活性而介导线粒体途径的细胞凋亡[8]。Bcl-2是一种抗细胞凋亡因子，能阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，抑制细胞凋亡，并且还可以通过抗氧化作用或抑制氧自由基产生来阻止细胞凋亡，阻断细胞死亡级联[9]。有研究表明，Bcl-2在海马神经元凋亡损伤过程中起重要作用[10]。Bax是一种与Bcl-2功能相反的基因，能促进细胞凋亡，Bcl-2与Bax之间的平衡能决定细胞是否发生凋亡[11]。Jafari等[12]研究发现，糖尿病大鼠海马Bax/BcL-2表达增加，细胞凋亡增加。Yang等[13]研究发现，慢性不可预见性应激大鼠海马存在着Bax蛋白的上调和Bcl-2蛋白的下调。本实验结果表明，DD大鼠JNK、Bax蛋白及基因表达明显上升，Bcl-2表达下降，予左归降糖解郁方干预后，JNK、Bax表达明显下降，Bcl-2上升。上述结果表明，左归降糖解郁方能通过抑制JNK的表达，调节抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之间的平衡，起到抑制海马神经元凋亡的作用。

DD继发于糖尿病，其中医病机可用“虚、瘀、郁”概括，表现为气阴两虚、瘀阻脑络、血瘀肝郁、情志异常等。本研究结果表明，予左归降糖解郁方干预后，DD大鼠学习记忆功能改善，其治疗作用可能与抑制海马神经元凋亡，保护海马组织密切相关。

参考文献：

[1] POWER F. Should we screen for emotional distress in type 2 diabetes mellitus[J]. Nature Reviews Endocrinology，2009，5（12）：665-671.

[2] 杨蕙，王宇红，张秀丽，等.慢性应激对2 型糖尿病大鼠HPA轴紊乱及海马损伤的影响[J].中华中医药学刊，2014，32（11）：2660-2663.

[3] WANG Y H， YANG H， LI W， et al. Zuogui Jiangtang Jieyu Formulation prevents hyperglycaemia and depressive-like behaviour in rats by reducing the glucocorticoid level in plasma and hippocampus[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine，2015，7：1-10.

[4] WESTON C R， DAVIS R J. The JNK signal transduction pathway[J]. Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）：142-149.

[5] 王宇红，谭小雯，柴上，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马谷氨酸及N-甲基-D-天冬氨酸受体2A、2B的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（10）：70-73.

[6] 王宇红，谭小雯，赵洪庆，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马星形胶质细胞GFAP、S100B的影响[J].时珍国医国药，2015， 26（8）：1808-1811.

[7] 张秀丽，王宇红，杨蕙，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠学习记忆及海马超微结构的影响[J].时珍国医国药，2015，26（4）：787-789.

[8] BOGOYEVITCH M A， KOBE B. Uses for JNK：the many and varied substrates of the c-Jun N-terminal kinases[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（4）：1061-1095.

[9] 孟盼，王宇红，张秀丽，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：203-207.

[10] KOSTEN T A， GALLOWAY M P， Duman R S. Repeated unpredictable stress and antidepressants differentially regulate expression of the bcl-2 family of apoptotic genes in rat cortical， hippocampal， and limbic brain structures[J]. Neuropharmacology，2008，33（7）：1545-1558.

[11] CALVINO E， TEJEDOR M C， SANCHO P， et al. JNK and NFκB dependence of apoptosis induced by vinblastine in human acute promyelocytic leukaemia cells[J]. Cell Biochem Funct，2015，33（4）：211-219.

[12] JAFARI ANARKOOLI， SANKIN M， AHMADPOUR S， et al. Evaluation of BCL-2 family gene expression and Caspase-3 activity in hippocampus STZ-induced diabetic rats[J]. Experimental Diabetes Research，2008，12：1-6.

[13] YANG D Y， LIU X， ZHANG R F， et al. Increased apoptosis and different regulation of pro-apoptosis protein bax and anti- apoptosis protein bcl-2 in the olfactory bulb of a rat model of depression[J]. Neuroscience Letters，2011，504（1）：18-22.