胃溃疡肝郁证候大鼠模型的建立及其评价

孙剑端 任路 邓雪 傅沈康 李静

摘要：目的 探讨胃溃疡肝郁证候动物模型的建立及电针的治疗作用。方法 采用Open-field法选择60只SD大鼠，适应性喂养7 d，随机分为空白组、模型组、模型对照组和电针组，每组15只。除空白组外，其余3组均采用慢性不可预见性刺激合并醋酸烧灼法建立胃溃疡抑郁证大鼠模型。模型对照组继续慢性不可预见性刺激，电针组电针“肝俞”“梁丘”治疗，连续13 d。观察大鼠一般状态、旷场实验结果、溃疡指数，RT-PCR检测海马组织脑源性神经营养因子（BDNF），ELISA检测血清胃泌素（GAS）含量。结果 实验第21日，除空白组外其余3组大鼠出现精神萎靡、四肢无力、被毛乏泽、食欲降低等表现。实验第34日，模型对照组大鼠一般状况表现较模型组严重，电针组大鼠一般状况明显改善，模型组大鼠水平和垂直穿格数较空白组显著减少（P<0.01），与模型组比较，模型对照组大鼠水平和垂直穿格数显著减少（P<0.05），电针组大鼠水平和垂直穿格数显著增加（P<0.01）；模型组大鼠溃疡指数较空白组显著升高（P<0.01），与模型组比较，模型对照组大鼠溃疡指数显著升高（P<0.05），电针组大鼠溃疡指数显著下降（P<0.01）；模型组海马组织BDNF mRNA表达较空白组显著下降（P<0.01），与模型组比较，模型对照组海马组织BDNF mRNA表达显著下降（P<0.05），电针组海马组织BDNF mRNA表达组显著升高（P<0.01）；模型组大鼠GAS含量较空白组显著升高（P<0.01），与模型组比较，模型对照组大鼠GAS含量显著升高（P<0.05），电针组大鼠GAS含量显著降低（P<0.05）。结论 通过复合方式建立病证结合胃溃疡肝郁证候动物模型可行，电针“肝俞”和“梁丘”对该模型有治疗作用。

关键词：胃溃疡；肝郁；模型；电针；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.014

中图分类号：R228；R332 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0056-05

Establishment and Evaluation of Gastric Ulcer Liver Depression Syndrome Rat Model SUN Jian-duan1， REN Lu2， DENG Xue2， FU Shen-kang2， LI Jing3 （1. 521 Hospital of Norinco Group， Xian 710000， China； 2. College of Acupuncture and Massage， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China； 3. Shaanxi Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xian 710000， China）

Abstract： Objective To discuss the establishment of gastric ulcer liver depression syndrome rat model and the therapeutical effects of electroacupuncture. Methods As the result of Open-field experimental method， 60 SPF male SD rats were selected as experimental animals. After 7 days of adaptive feeding， 60 rats were randomly divided into blank group， model group， model control group， and electoracupuncture group， 15 rats in each group. Except for the blank group， the other three groups were stimulated by chronic unpredictable stimulation to establish rat depression model. Then model control group was once again stimulated by chronic unpredictable stimulation for 13 days； electoracupuncture group was treated at Gan Shu （BL18） and Liang Qiu （ST34） acupoints for 13 days. General state of rats， Open-field experimental results and gastric ulcer index were observed. BDNF was measured by RT-PCR. GAS content was measured by ELISA. Results After modeling for 21 days， except for the blank group， the other three

基金项目：国家自然科学基金（81373718）；辽宁省自然科学基金（2013020179）；辽宁省教育厅科学研究项目（L2012339）； 辽宁省科技攻关项目（2009225010-36）；沈阳市高新技术产业发展与科技攻关计划（F12-193-9-37）；沈阳市科技局应用基础 研究专项（F13-318-1-67）

groups appeared listlessness， limb weakness， and fur dry and lose luster， appetites reduced， etc. After modeling for 34 days， compared with model group， model control group had more severe general state than model group. After acupuncture treatment， the general state of acupuncture group was improved. The horizontal and vertical activity sore in model group decreased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the horizontal and vertical activity sore in model control group decreased significantly （P<0.05）， and increased significantly in the electroacupuncture group （P<0.01）. Ulcer index in the model group increased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Ulcer index in the model control group increased significantly compared with the model group （P<0.01）. Ulcer index in electroacupuncture group decreased significantly （P<0.01）. BDNF mRNA expression in hippocampus of model group decreased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with model group， the BDNF mRNA expression in hippocampus of model control group decreased significantly （P<0.05）. The BDNF mRNA expression in the electroacupuncture group increased significantly （P<0.01）. The GAS content in the model group increased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the GAS content in the model control group increased significantly （P<0.05）. The GAS content in the electroacupuncture group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion The establishment of depressive rat gastric ulcer model which combining disease and syndrome together proves the feasibility of this animal experimental model. Electroacupuncture for Gan Shu （BL18） and Liang Qiu （ST34） can improve the efficacy of this model.

Key words： gastric ulcer； depression； animal models； electroacupuncture； rats

随着生物医学模式向社会-心理-生物医学模式转变，越来越多的疾病受到情感情绪变化的影响。中医学认为，情志不遂、忧思恼怒、肝气郁结可致胃脘疼痛、纳呆、胀满。清代叶天士提出“肝为起病之源，胃为传病之所”，强调情志因素在脾胃病中的重要作用。有研究显示，消化性溃疡和功能性胃肠疾病的发生与抑郁情绪密切相关[1-2]。本实验依据上述理论，探讨胃溃疡肝郁证候模型的建立及电针的治疗作用，为建立病证结合的动物模型提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠60只，2月龄，体质量140～200 g，辽宁中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（辽）2010-0001。饲养于室温18～23 ℃、相对湿度35%环境，每日光照时间约为11 h。

1.2 主要试剂与仪器

10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司），DAB显色试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司），脑源性神经营养因子（BDNF）扩增产物（北京三博远志生物科技有限公司），DL2000 DNA marker（北京全氏金生物科技有限公司），胃泌素（GAS）ELISA试剂盒（上海越研生物科技有限公司）。自制旷场实验箱（80 cm×80 cm×40 cm），并将旷场等分为25小格；酶标仪、PCR仪、电泳仪，北京六一仪器厂；电针治疗仪，广东汕头市医用设备厂；华佗牌0.25 mm×25 mm不锈钢针灸针，苏州医疗器械。

2 实验方法

2.1 分组

采用Open-field法[3]进行行为学评分，选择得分相近的60只大鼠，适应性喂养7 d，随机分为空白组、模型组、模型对照组、电针组，每组15只。

2.2 造模

抑郁症大鼠模型参照文献[4]方法并改良，制作传统慢性不可预见性刺激模型，造模21 d。刺激：断水、断食24 h，夹尾5 min；摇晃：1次/s，连续5 min；昼夜颠倒；电击足底，电压50 mV，每5 s刺激1次，间歇5 s，共刺激10次；束缚2 h（使大鼠头部在行为限制筒的开口端，不影响其呼吸为宜）。每日随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，2 d内同一刺激不在相同个体上重复执行，共21 d。

参照文献[5]制作胃溃疡模型。抑郁症造模第10日进行胃溃疡模型的制作，实验前大鼠禁食24 h，不禁水，称重，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，胸腹部剃毛、消毒、打开腹腔（手术切口长约2 cm），暴露出胃，在胃窦近胃体处浆膜层下注射90%冰醋酸0.01 mL，注射后胃壁表面立即形成一个圆形或椭圆形隆起，然后隆起变平出现一个圆形或椭圆形的乳白色不透明区，直径为4～5 mm，用缝线将大网膜固定于注射区，以防穿孔，逐层缝合切口，涂上一层稀释的火棉胶，保护伤口。胃溃疡造模成功后继续进行慢性不可预见性刺激，刺激满21 d 为止。

2.3 干预

模型组给予抓取固定刺激13 d；模型对照组继续进行慢性不可预见性刺激13 d；电针组每日行电针治疗，穴位选择参照《实验针灸学》取穴[6]。在大鼠安静状态下，针刺双侧“梁丘”（双后肢膝关节外上5 mm处，直刺4～5 mm），“肝俞”（大鼠背部、约第9胸椎棘突下两旁肋间，直刺6 mm）。针刺手法采用平补平泻。电针治疗仪将同侧“肝俞”“梁丘”接正负极，给予电压2 V，疏密波型，疏波4 Hz，密波20 Hz，强度以局部皮肤肌肉轻微颤动为度，留针20 min，每日1次，连续6 d，中间休息1 d，2周为1个疗程，共13 d。实验结束时，剔除实验中死亡大鼠，空白组、模型组、模型对照组、电针组各取10只。 2.4 一般状况观察

实验过程中观察记录大鼠一般情况，包括体质量、饮食饮水、活动度、精神状态、毛色等。

2.5 旷场实验

所有实验大鼠实验第1日（实验开始前）、第21日（造模结束后）、第34日（治疗后）进行旷场实验。用白线将自制旷场实验箱划分成25个16 cm×16 cm小正方形。实验时选在安静的房间，将大鼠放在中央格子中，同时用摄像机记录大鼠运动行为。3 min/只观察水平运动、垂直运动（以动物四爪全部穿越的格数为准）。

2.6 指标检测

实验结束后大鼠禁食12 h，经腹主动脉采血，静置4 h，4000 r/min离心5 min分离血清，取上清液，4 ℃冰箱冷藏备用。ELISA检测血清GAS，按照试剂盒说明书进行。断颈处死大鼠充分暴露腹腔，取出整胃，沿胃大弯剪开，将胃平铺在滤纸上，内膜向上，显露溃疡面，采用GUTH法计算溃疡指数[7]。损伤≤1 mm（包括斑点糜烂）计1分，1 mm<损伤≤2 mm计2分，2 mm<损伤≤3 mm计3分，3 mm<损伤≤4 mm计4分，损伤≥4 mm计5分。切下大鼠头颅，冰上开颅，剥取大脑海马组织，放入EP管中，-80 ℃冰箱冻存，加入裂解液，使用匀浆机将组织彻底研磨，氯仿抽提，12 000 r/min离心并提取上层水相，去蛋白并离心等，重新溶解RNA；鉴定RNA提取纯度；将mRNA反转录为cDNA，鉴定cDNA纯度。PCR反应引物序列：BDNF上游5'-GGGGTTAGGAGAA GTCAAGC-3'，下游5'-CAGTGGGACTCCAGAAGA CA-3'，扩增产物长度288 bp；β-actin上游5'-ATC ATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，下游5'-CATCTC TTGCTCGAAGTCCA-3'，扩增产物长度318 bp，进行琼脂糖凝胶电泳。利用条带亮度表示BDNF mRNA的含量，亮度越强则含量越高，表明海马BDNF mRNA表达数量越多；反之，则表明mRNA表达越少。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析和LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况结果

造模前4组大鼠一般状态良好，皮毛光泽，精神状态良好，行动迅速，饮食正常，排泄正常，体质量增加。实验21日除空白组外其余3组大鼠一般状况较差，眼常闭着、精神萎靡、俯卧蜷缩、四肢无力、拱背少动、体毛干枯无光泽、食欲降低，大便变软、颜色较浅、少数呈稀糊状，溃疡术后数日内曾有黑便。实验34日空白组大鼠状态同造模前，模型组大鼠一般状况较差，大鼠被毛乏泽蓬松、反应迟缓、精神不振、活动度减少、食欲降低、体质量增加缓慢，大便变软、颜色较浅、少数呈稀糊状；模型对照组大鼠一般状况较模型组严重，大鼠毛色变暗、枯黄，眼睛眯小、有眼屎，胡须下垂、叫声尖细、贴边扎堆及蜷曲蹲伏，少食厌食，消瘦，体质量减轻，便质大多稀溏；电针组大鼠一般状态恢复较好，被毛恢复光泽，精神状态正常，饮食好转，大便质地恢复正常。

4.2 旷场实验结果

造模前各组水平和垂直活动与空白组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；造模后各组水平活动和垂直活动与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01），表明大鼠在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度有所改变，符合抑郁症模型行为学的改变。治疗第34日，模型对照组在慢性不可预见性刺激下大鼠水平和垂直穿格数较模型组显著减少（P<0.05），说明慢性不可预见性刺激可加重抑郁倾向；电针组较模型组大鼠水平和垂直穿格数显著增加（P<0.01），表明电针“肝俞”“梁丘”，可改善大鼠的抑郁状态。结果见表1、表2。

4.3 电针对模型大鼠溃疡指数的影响

与空白组比较，模型组溃疡指数显著升高（P<0.01）；与模型组比较，模型对照组溃疡指数显著升高（P<0.05），电针组溃疡指数显著下降（P<0.01）。 结果见表3。

4.4 电针对模型大鼠海马脑源性神经营养因子mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马组织BDNF mRNA表达显著下降（P<0.01）；与模型组比较，模型对照组大鼠海马组织BDNF mRNA表达显著下降（P<0.05），电针组大鼠海马组织BDNF mRNA表达升高（P<0.01）。结果见图1、表4。

4.5 电针对模型大鼠血清胃泌素含量的影响

模型组较空白组GAS含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，模型对照组GAS含量显著增加（P<0.05），电针组GAS含量显著降低（P<0.05）。结果见表5。

5 讨论

消化性溃疡患者在临床上表现出具有较强的抑郁和/或焦虑的负面情感因素，其心理异常率明显高于正常人群[8]。这种高发率的抑郁症状尤其表现在综合医院门诊及住院患者身上[1]。为了有效、深入地研究该病的发病机制以及电针的治疗作用，建立有效可行的动物模型十分重要。

目前大鼠溃疡模型中以冰醋酸性模型在实验研究中应用较广[9]。本实验选用注射冰醋酸烧灼法复制慢性胃溃疡模型，直接以冰醋酸烧灼胃浆膜形成溃疡。此模型方法可靠，重复性好，溃疡深而大，与人类的慢性胃溃疡极为相似[10]。慢性不可预见性刺激抑郁症动物模型作为环境应激模型的一种，更接近于理想的抑郁症模型，即能模拟人类抑郁症的核心症状，模型可操作性和可复制性好，为抑郁症发病机制的研究提供良好的模型基础。有研究表明，长期不可预见的中等强度应激造成的大鼠抑郁症模型，表现出一系列情绪行为改变，与人类抑郁症有一定相似性[11]。中医认为长期情志不良可导致消化道疾病的出现，且二者互相影响。单纯的情志刺激在动物实验很难出现稳定状态的消化道疾病，不具有可行性，需要人为控制的因素很多，包括时间周期的长短选择。因此，我们将现代医学抑郁症造模方法和胃溃疡造模方法结合，先开始一段时间的抑郁症造模，再在此基础上进行冰醋酸烧灼法复制胃溃疡模型。选择海马组织BDNF和血清GAS作为判断胃溃疡肝郁的指标，并作为电针治疗后的参照量，用反证法说明此模型的可行性；并通过模型对照组和模型组的比较，体现出长期反复的不可预见性刺激对于溃疡的愈合确有一定影响。

动物模型的评价，通常用表面效度、结构效度和预测效度进行综合评价[12]。就本实验来言，表面效度即通过大鼠一般行为、旷场实验结果显示，模型动物的情绪表现类似于人类相应情绪表现。造模结束后，除空白组外，其余3组大鼠一般状况较差，出现精神萎靡、俯卧蜷缩、拱背少动、体毛干枯乏泽、食欲降低等改变；模型对照组再继续慢性不可预见性刺激，其一般状况较之前更差；旷场实验结果显示，模型对照组大鼠活动度较模型组明显减少。结构效度是通过溃疡指数、海马组织BDNF和血清GAS的改变表明动物模型与人类疾病产生的原因具有相似性。实验结果显示，溃疡指数模型对照组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），表明继续慢性不可预见性刺激或不良情志的刺激，可加重溃疡的形成。BDNF作为神经营养因子家族的主要成员之一，参与抑郁的病理生理过程，是抑郁障碍的易感基因，BDNF及其受体水平下降可能是导致抑郁症的主要发病机制。实验结果显示，模型对照组海马组织BDNF mRNA表达较模型组减少，表明不良的情志刺激可加重抑郁状态，与前期研究结果一致。GAS作为一种胃肠道内分泌激素，其血清表达量与胃溃疡的发生呈正相关趋势。在临床实践中，血清GAS含量的变化被认为是消化道炎症和/或溃疡患者的血清学标志物[13]。实验结果显示，模型对照组血清GAS含量增加，加重或促进了溃疡的形成。预测效度是通过电针组与模型组的比较，说明电针对此模型具有治疗作用。电针“肝俞”“梁丘”后，大鼠活动度明显增加，溃疡指数较模型组减少，大鼠海马组织BDNF mRNA表达升高，血清GAS含量较模型组减少。通过以上3种效度的综合评价，可以说明此模型具有可行性。

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