尾菜液体青贮菌剂制备及应用

邵建宁，彭章普，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

尾菜液体青贮菌剂制备及应用

邵建宁，彭章普，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SD2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)SD4在5 L立瓶中分别进行培养，制备尾菜液体青贮菌剂。结果表明，在MRS液体培养基中37℃条件下，调控pH值，菌株SD2和SD4最适收获期分别为24 h、20 h，菌株SD2与SD4配比为2∶1时青贮效果最佳，尾菜液体青贮菌剂总活菌数＞1×109CFU/mL。按0.5%接种量，进行废弃白菜叶、青笋叶青贮发酵应用试验，生产的尾菜青贮饲料品质良好，颜色淡黄色或黄绿色，酸香味浓郁，质地较松散，pH值＜4.0。研制的尾菜青贮菌剂适用于尾菜青贮。

尾菜；乳酸菌；青贮菌剂；制备；应用

随着蔬菜产业的发展，蔬菜在收获、净菜加工、商品化处理与销售环节，产生大量的尾菜。由于蔬菜产品具有较强的季节性，收获和上市期短而集中，大量尾菜未被合理处理利用，而是当作垃圾随意堆放或者简单填埋，使尾菜不仅被浪费，而且造成了环境污染，给蔬菜产区的农业生产、农民生活、农村生态带来了极大的负面影响[1-2]。尾菜中有机物和水分含量高，易腐烂变质不宜贮存。为解决尾菜污染环境，实现尾菜资源化利用，对经过分捡后无腐烂变质的尾菜进行青贮饲料制备，可以降低尾菜的营养物质损失，较长期保存尾菜的青鲜状态，提高尾菜青贮饲料的适口性、消化率和营养价值[3-6]。添加乳酸菌青贮，从青贮开始时，乳酸菌就成为优势菌群主导发酵进程，可以快速产生乳酸，迅速降低pH值，从而抑制腐败菌活动，加速青贮料发酵，减少营养成分损失，使尾菜中养分可以较好地保存，并使尾菜青贮饲料的品质得到显著改善。国外许多研究者对乳酸菌在青贮饲料制备中的作用和应用进行了大量深入的研究，而我国在青贮饲料乳酸菌添加剂方面的研究应用还十分薄弱[7-13]。目前专门针对用于尾菜青贮的乳酸菌研究很少，自然青贮又不能保证尾菜青贮的品质。

本研究利用5 L立瓶进行尾菜青贮饲料发酵工艺研究，对选用的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SD2、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SD4的培养确定了最适收获期和配比，并对制备的尾菜液体青贮菌进行了应用试验，目的是提高尾菜青贮饲料品质，取得良好的青贮效果，为尾菜液体青贮菌剂的工业化生产提供实验数据和科学依据。对防止尾菜造成环境污染，减少尾菜浪费，实现尾菜资源化利用和促进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SD2、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SD4：甘肃省科学院生物研究所保藏。

1.1.2培养基

MRS培养基[14]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，吐温80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水1L，pH 6.8。MC培养基[15]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，琼脂粉15 g/L，中性红0.05 g/L，蒸馏水1 L，pH值6.0。

1.1.3尾菜

无腐烂变质的废弃白菜叶、青笋叶：兰州定西南路菜市场。

1.1.4化学试剂

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐温-80：上海大众制药厂；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工厂。所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2仪器与设备

5 L立瓶：成都蜀玻集团；DELTA 320 pH计：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）集团公司；UV-120-02型分光光度计：日本岛津公司；JA2003N电子天平：上海精密仪器有限公司；DG-1多功能培养箱：上海医疗器械修造厂；BH-2显微镜：日本奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3方法

1.3.1液体青贮菌剂制备

将试管活化好的菌种，按5%（V/V）接种量接入500 mL三角瓶进行种子液培，37℃培养12 h。将三角瓶种子液按体积比5%的接种量接入5 L立瓶，在37℃条件下进行发酵培养，当pH＜5.5时用6 mol/L NaOH溶液调节发酵菌液pH至6.0～6.5。植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4在各自调控pH值培养的生长曲线达到最高值时，终止发酵。以未调控pH值的菌株培养为对照，通过镜检确定没有杂菌，进行菌落计数，确定菌液活菌数＞1×109CFU/g，备用。

1.3.2生长曲线的测定

菌种活化扩培后，以5%（V/V）接种量（菌种活菌数约为1×108CFU/mL）接种于液体MRS培养基中，37℃条件下培养32 h，分别于0、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h取样，用分光光度计在波长600 nm条件下比色，测定菌液的吸光度值。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3.3活菌数测定

（1）发酵菌液活菌数测定

取1 mL待测定发酵菌液，用稀释液进行10倍梯度稀释，选取10-6、10-7稀释梯度，吸取0.2 mL菌悬液置于MRS琼脂平板上，每个稀释梯度做3个平行，以灭菌的涂布器将菌悬液均匀涂开，然后将平板倒置于培养箱中，37℃条件下培养48 h，进行菌落计数[16-17]。

（2）尾菜饲料乳酸菌总数测定

取5 g尾菜青贮饲料和45 mL无菌水混匀，以10倍梯度稀释，选取10-5、10-6稀释梯度，吸取0.2 mL菌悬液用涂布棒涂布于MC琼脂平板上，培养48 h后，选择菌落为红色、周围有明显溶钙环的菌落进行计数（乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解，出现溶钙环，中性红为pH指示剂）。

1.3.4pH值测定

称取尾菜青贮样品20 g，加入180 mL蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎，然后用4层纱布纱布和滤纸分别进行过滤，测定过滤液的pH值。

1.3.5营养成分检测

粗蛋白测定采用国标GB/T6432—1994《饲料中粗蛋白测定方法》；粗脂肪测定采用国标GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定方法》；粗纤维测定采用国标GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维测定方法》。

1.3.6菌株配比确定

植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4的发酵液按活菌数比例1∶1、2∶1、1∶2进行配比，按0.5%接种量接种到经过预处理的废弃白菜叶、青笋叶中，装袋压实封口，每组3平行。置于恒温培养箱中，30℃条件下青贮发酵，分别于0～10 d每天取样，测定各袋样品中的pH值。

1.3.7青贮发酵试验

挑选无腐烂变质的废弃白菜叶、青笋叶进行清洗，切割成长2 cm、宽3 cm，采用晾晒使废弃白菜叶、青笋叶水分含量降至70%左右。将分别发酵好的植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4按一定比列混合，制备的尾菜液体青贮菌剂总活菌数＞1.0×109CFU/mL，尾菜液体青贮菌剂按照接种量0.5%，分别均匀喷洒到5 000 g青笋叶、5 000 g白菜叶中，装入单向排气阀青贮袋，装袋后压实、袋口密封，在30℃条件下发酵7 d，测定尾菜青贮饲料pH值及活菌数，综合尾菜青贮饲料感官指标，评价液体青贮菌剂的发酵性能。

2　结果与分析

2.1最适发酵时间的确定

乳酸杆菌在生长繁殖过程中分解代谢产生酸，随着酸度的升高，pH值的下降，乳酸杆菌的生长受到抑制。为了促进乳酸杆菌的生长和繁殖，植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4各自在5 L立瓶培养过程中，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制各自调节pH组和对照组的生长曲线，结果见图1。

由图1可知，植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4调节pH组的乳酸菌数明显高于对照组。植物乳杆菌SD2在24 h左右达到生长高峰期，之后趋于稳定。因此，选择发酵时间24 h为植物乳杆菌SD2的最佳收获期，此时发酵液活菌数可达1.8×109CFU/mL。发酵乳杆菌SD4在20 h左右达到生长高峰期，之后趋于稳定。因此，选择发酵时间20 h为发酵乳杆菌SD2的最佳收获期，此时发酵液活菌数可达1.7×109CFU/mL。

图1　植物乳杆菌SD2及发酵乳杆菌SD4生长曲线Fig.1　Growth curves ofL.plantarumSD2 andL.fermentumsSD4

2.2单菌与混菌青贮发酵

将植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4与SD2和SD4按活菌数1∶1混菌接种在预处理后的废弃白菜叶、青笋叶中，测定尾菜青贮饲料pH值，结果见图2。

图2　不同菌株青贮过程中pH变化Fig.2　pH changes of different strains in the process of silage

由图2可知，SD2和SD4混菌发酵较单菌株发酵pH降低快，在5 d内pH降低到4.0以下，单菌株SD2、SD4青贮发酵在7 d内发酵pH降低到pH4.0以下。单菌与混菌青贮发酵7 d后pH值、乳酸菌活菌数及尾菜青贮饲料感官指标，结果见表1。

表1　不同菌株青贮尾菜感官结果Table 1　Evaluation of vegetable wastes ensiled by different strains

由表1可知，菌株SD2、SD4发酵废弃白菜叶、青笋叶7 d后，尾菜青贮饲料pH均低于4.0，乳酸菌数量大于1.0× 108CFU/g，颜色、气味、质地等感官指标良好，适合用于尾菜青贮饲料的发酵。菌株SD2和SD4混菌青贮发酵pH降低较快，说明混菌发酵较单菌发酵更具优势。

2.3菌株配比确定

植物物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4的混菌发酵液按活菌数1∶1、2∶1、1∶2比进行配比，按0.5%接种量接种到废弃白菜叶、青笋叶中，30℃条件下青贮发酵，分别于0～10 d内每天取样，测定各袋样品中的pH值，结果见图3。

由图3可知，植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4菌株间不同的配比，其pH值变化趋势不同，产生了不同的发酵过程。在发酵初期，各处理的pH值相近，在发酵7 d后到pH变化均趋于稳定。植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4配比为2∶1的青贮试验pH值最低，其pH值下降速率也最快，在4 d时pH值下降至4.0以下，7 d后下降缓慢，基本趋于稳定。因此，当植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4菌株活菌数的配比为2∶1时，充分发挥了其协同作用，能快速启动发酵，产生大量的有机酸使环境中的pH值迅速降低，最后稳定在3.8左右，有利于尾菜青贮饲料的长期保存。

图3　菌株不同配比青贮发酵过程中pH变化Fig.3　pH changes of different ratio of the strains in the process of silage fermentation

2.4青贮效果评定

植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4菌株活菌数的配比为2∶1，按0.5%接种量分别喷洒到废弃白菜叶、青笋叶中。通过目测、嗅闻、手感感官检验，pH值测定和活菌数计数，判断青贮饲料发酵效果，结果见表2。废弃白菜叶、青笋叶在青贮前后营养成分变化结果见表3。

表2　尾菜液体青贮菌剂发酵尾菜结果Table 2　Results of vegetable wastes fermented by liquid silage bacterial inoculants

由表2可知，制备的尾菜液体青贮剂接种废弃白菜叶、废弃青笋叶发酵7 d后发酵效果较好，pH值均＜4.0，达到了较长期保存尾菜的效果。其中青贮废弃白菜叶颜色淡黄色，酸香味浓郁，质地较松散、柔软、不发粘，7 d后pH值为3.85，乳酸菌总数达到3.6×108CFU/g。青贮废弃青笋叶，颜色黄绿色，酸香味浓郁，质地松散、柔软、不发粘，7 d后pH值为3.9，乳酸菌总数达到3.3×108CFU/g。使用制备的尾菜液体青贮剂对废弃白菜叶、青笋叶进行青贮发酵试验，进一步证明植物乳杆菌SD2、发酵乳杆菌SD4共同作用青贮发酵效果良好（见表3）。

表3　尾菜青贮前后营养成分变化Table 3　Changes of nutrition components of vegetable wastes before and after the silage

由表3可知，尾菜青贮后粗蛋白和粗脂肪含量均有提高，粗纤维含量略有降低，从青贮后营养成分变化分析，使用制备的尾菜液体青贮剂提高了原尾菜营养性和可消化率。

3　结论

植物乳杆菌SD2在MRS液体培养基中37℃培养，通过调控pH值，24 h左右活菌数达到最大值，发酵液活菌数可达1.8×109CFU/mL；发酵乳杆菌SD4在MRS液体培养基中37℃培养，通过调控pH值，20 h左右活菌数达到最大值，发酵液活菌数可达1.7×109CFU/mL。

植物乳杆菌SD2与发酵乳杆菌SD4活菌数配比2∶1，按质量比0.5%接种量接种，30℃青贮尾菜在4 d时pH值下降至4.0以下，7 d基本趋于稳定。制备的尾菜液体青贮菌剂发酵废弃白菜叶、废弃青笋叶，青贮效果良好，尾菜青贮饲料颜色淡黄色或黄绿色，酸香味浓郁，质地较松散、柔软、不发粘，尾菜青贮饲料pH值均＜4.0，达到了较长期保存尾菜的要求。

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Preparation and application of bacterial inoculants for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing (Institute of Biology,Gansu Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By the cultivation ofLactobacillus plantarumSD2 andLactobacillus fermentumSD4 in 5 L roller bottle,the bacterial inoculants for vegetable wastes silage were prepared.The results showed that in MRS liquid medium,at fermentation temperature 30℃,by adjusting pH value,the optimum harvesting time ofL.plantarumSD2 andL.fermentumSD4 were 24 h and 20 h,respectively.Under the condition ofL.plantarumSD2 and L.fermentumSD4 ratio 2∶1,the silage effect was the optimum,and the total viable count of bacterial inoculants for vegetable wastes silage was more than 1×109CFU/ml.The waste Chinese cabbage leaves and asparagus leaves were fermented by silage bacteria inoculants with inoculum 0.5%,and the vegetable wastes silage had good quality,light yellow or yellowish green color,strong acid fragrance and friable texture.The both vegetable wastes silage pHs were less than 4.0.The silage bacteria inoculants developed were suitable for the vegetable wastes silage.

vegetable waste;Lactobacillus;silage bacterial inoculants;preparation;application

Q939.97

0254-5071（2016）10-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.021

2016-08-11

兰州市科技计划项目(2012-2-143）

邵建宁（1971-），男，高级工程师，本科，主要从事生物工程应用基础研究工作。