超高压对峰甘板栗中主要微生物的影响及其货架期预测

郭豪宁，赵玉华,2,3，常学东,2,3*，李聪，姚园

1(河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎，066600) 2(河北省板栗工程技术研究中心，河北 昌黎，066600) 3(河北省燕山特色农业技术产业研究院，河北 昌黎，066600)



超高压对峰甘板栗中主要微生物的影响及其货架期预测

郭豪宁1，赵玉华1,2,3，常学东1,2,3*，李聪1，姚园1

1(河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎，066600) 2(河北省板栗工程技术研究中心，河北 昌黎，066600) 3(河北省燕山特色农业技术产业研究院，河北 昌黎，066600)

为探讨超高压对真空包装峰甘板栗微生物及感官质量的影响及建立微生物生长模型预测其货架期，在16～18 ℃对真空包装峰甘板栗进行200 MPa(5、10、15 min)、300 MPa(5、10、15 min)、400 MPa(5、10、15 min)、500 MPa(5、10、15 min)超高压处理。样品处理后于4 ℃保藏60 d，每隔10 d取样分析，直至样品微生物数量达到安全卫生限值1 000 CFU/g及感官质量不可接受为止。结果表明，与空白对照组相比，超高压处理能显著降低峰甘板栗初始微生物数量，并对影响货架期的腐败微生物：大肠菌群、霉菌、酵母有显著抑制作用，抑制程度与压力(200～500 MPa)和处理时间(5～15 min)具有正相关性；试验中所建立的Gompertz模型能有效地拟合不同超高压处理峰甘板栗在货架期间菌落总数的动态变化，有效地评估峰甘板栗的货架寿命和贮藏安全性，500 MPa处理5、10、15 min均能够将峰甘板栗4 ℃贮藏微生物货架期从9 d延长至60 d以上；但结合感官质量评定结果，300 MPa处理15 min最佳可延长货架期至38 d。

超高压(ultra high pressure, UHP)；真空包装；峰甘板栗；微生物；货架期

峰甘板栗是一种高淀粉的坚果类制品，具有淡雅的鲜栗味，口感甜美，营养丰富。由于加工过程和包装过程易造成微生物污染导致货架期很短，即使在真空包装且冷链保藏的条件下，货架期也只有10天左右，影响峰甘板栗产品的主要微生物是菌落总数、大肠菌群、霉菌及酵母菌、沙门氏菌。

超高压(ultra high pressure, UHP)杀菌是一种新型非热杀菌加工技术[1]，应用于蔬菜、肉制品、饮料等不同类型的食品中[2-6]，可以抑制微生物的生长，显著延长货架期并不破坏食品营养及感官品质。超高压食品的可接受性也日趋提高[7]，国外开展了大量的超高压对食品保鲜方面的研究[8-10]。但是超高压处理的产品中仍然存在未致死的微生物，它们在保藏过程中会复活、生长从而造成腐败[11]。为有效控制超高压处理产品的安全性，预测其货架期，引入微生物预测模型是一种较好的方法。预测食品微生物学(Predictive Microbiology)是以建立各种食品微生物在不同条件下的特征信息库为基础，运用微生物学、工程数学以及统计学进行数学建模，应用计算机配套软件判断食品内微生物生长或残存的动态变化的预测方法，能快速、真实地评估食品的质量和安全性[12-13]。Gompertz函数模型能有效地描述和预报食品微生物的生长状况。目前，预测微生物学在食品工业中主要应用于食品货架期的设定和食品的安全评估。针对微生物的预测模型有多种，综合一级模型、二级模型、三级模型就可以把大部分模型表示出来[14-15]。

本实验中将200 MPa(5、10、15 min)、300 MPa(5、10、15 min)、400 MPa(5、10、15 min)、500 MPa(5、10、15 min)超高压处理的真空包装峰甘板栗4 ℃的货架期，采用DPS软件建立微生物生长模型，并用改良的Gompertz模型分析不同超高压处理条件下峰甘板栗主要腐败微生物的生长动力学参数，探讨超高压杀菌工艺对峰甘板栗的可行性，同时为该产品货架期的预测提供参考。

1 材料与方法

1.1 峰甘板栗制备

将鲜板栗冷藏至糖度达到最大，约3个月左右，取出在温度：18 ℃，相对湿度：46%，光照条件：300 lx的条件下峰甘处理至口感风味最佳，使得水分含量达到33%～40%，可溶性总糖含量到达13%～17%[16]，剥壳，真空包装。

1.2 超高压处理

采用中国农业大学的“华泰森淼”HPP.L2-600/2型食品超高压设备，有效体积为3 L，最高压力为600 MPa，传压介质为水，水温为16～18 ℃，升压速率为100 MPa/min，解压时间为10 s，将包装好的峰甘板栗进行压力为200、300、400、500 MPa处理；保压时间分别为5、10、15 min。

1.3 样品贮藏

处理后的样品于(4±1)℃保藏30 d，以超高压处理后为保藏的第0 d，每隔10 d取样测定1次，当样品中的菌落总数超过产品标准规定值1 000 CFU/g[17]则停止取样，每个处理设置2次重复，3个平行，结果取平均值。

1.4 菌落种类的测定

(1)菌落总数：参照GB4789.2—2010《食品安全国家标准 微生物学检验菌落总数测定》。

(2)大肠菌群：参照GB4789.3—2010《食品安全国家标准 微生物学检验 大肠菌群计数》第一法，大肠菌群MPN计数法。

(3)霉菌和酵母菌：参考GB4789.15—2010《食品安全国家标准 微生物学检验 霉菌和酵母计数》。

(4)沙门氏菌：参考GB4789.4—2010《食品安全国家标准 微生物学检验 沙门氏菌检验》。

1.5 感官质量评定

感官质量评定指标包括4个方面:

外观色泽(产品是否呈现亮淡黄色，有无褐变现象，褐变有零星斑点还是大部分褐变)；气味滋味(产品有无淡雅的鲜栗香味，有无异味)；口感(是否香甜、软脆、咀嚼多汁、下咽有甘润感，有无渣滓感、部分栗肉较苦)；组织状态(产品的组织是否软脆，栗仁是否整齐)；由10人组成的感官小组按WILLIAMS[18]9点评分法进行打分。

标准：9=极好，8=很好，7=好，6=次好，5=—般，4=一般下，3=差，2=很差，1=极差；总分≥20且每项评分≥5为可接受。

1.6 数学模型

1.6.1 菌落总数拟合生长模型的建立

采用DPS软件分析数据，建立响应变量y=LgNt/N0(Nt为贮藏期间的菌落总数，N0为贮藏前的菌落总数)对贮藏时间t的数学模型。

1.6.2 微生物生长动力学初级模型

微生物生长动力学表征的是微生物数量与时间的关系，即微生物生长曲线，也是微生物预报模型中的初级模型，研究表明[19-20]，修正的Gompertz模型可以准确描述微生物(菌落总数、霉菌及酵母、沙门氏菌等)生长的动态趋势。

Gompertz模型是四参数双指数方程：

y=a×exp[-exp(b-ct)]

式中：y为t时刻的微生物数目;a、b、c为常数;t为时间。

ZWIETERING等将Gompertz模型中的3个参数a、b、c用具有生物学意义参数进行转换：

a=A，b=μmeλ/A+1，c=μmλ/A

得到修正的Gompertz方程如下[21]：

lgNt=lgN0+lg(Nmax/N0)×exp{-exp[μmax2.7182/lg(Nmax/N0) ×(λ-t)+1]}及lg(Nt)=lg(Nmax)-A×exp{-exp{[μmax×2.718 2×(-SL)/A]+1}}+A×exp{-exp{[μmax×2.7182×(λ-t)/A]+1}}

式中：t为样品贮藏时间，d；Nt为t时的菌数，1 g(CFU/g)；Nmax、N0分别为整个贮藏过程中最大和初始菌数，1 g(CFU/g)；λ为微生物生长的延滞期，d；μmax为微生物生长最大生长速率，d-1；e为数学常数，约等于2.718 2。A为从保藏时间t=0开始到微生物数量达到最大值Nmax的时间，d；SL为达到最高活菌数时的货架期，d。

1.7 数据分析

数据统计使用origin 8.5软件对数据进行拟合并绘图及DPS 9.5软件统计分析及Matlab7.0软件计算。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对峰甘板栗初始及保藏过程微生物的影响

由图1和图2可知，超高压处理对峰甘板栗微生物具有抑制作用，峰甘板栗对照组样品初始菌落总数为360 CFU/g，霉菌酵母数量为69 CFU/g，大肠杆菌<3 MPN/g，未检出沙门氏菌。综合GB19300—2014《食品安全国家标准 坚果与籽类食品》，DB11/622—2009《果仁、坚果制品卫生要求》，NY/T 1042—2014《绿色食品坚果》规定，产品的卫生要求微生物菌落总数应低于1 000 CFU/g，霉菌低于50 CFU/g，大肠菌群低于3 MPN/g，致病菌(沙门氏菌)不得检出。与对照组相比，超高压处理对菌落总数、霉菌酵母有显著抑制作用，微生物的抑制及杀灭与超高压水平和处理时间有关。此外，除了500 MPa处理10 min与15 min对霉菌酵母菌的抑制效果显著高于500 MP对a处理5 min，在处理压力相同的条件下，处理时间对初始微生物的降低作用没有显著性差异。CARPI等[22]对法兰克福香肠及肖志华等[23]对生鲜猪肉利用600 MPa的高压分别处理5、10、15、20 min，样品中菌落总数的降低程度与处理时间(5～20 min)成正相关，这与本试验结果一致。推断在一定范围内超高压处理强度是压力水平和处理时间的函数，而压力水平是抑制效果的最主要影响因素。

图1 峰甘板栗4 ℃保藏期间菌落总数的变化Fig.1 Growth curves of total bacteria count in Feng Gan chestnut stored at 4 ℃

图2 峰甘板栗4 ℃保藏期间霉菌及酵母菌的变化Fig.2 Growth curves of yeast and mold in Feng Gan chestnut stored at 4 ℃注：虚线表示峰甘板栗的微生物货架期标准。

菌落总数的迅速增长并高于微生物标准限量是影响货架期的主要原因之一，霉菌、酵母菌是真空包装峰甘板栗4℃贮藏的主要腐败菌。对照样在4 ℃保藏中，菌落总数、霉菌酵母菌和大肠菌群数量迅速上升(图1、图2)，大肠菌群的数量第10天达3.0 MPN/g，第20天达到3.6 MPN/g，超高压处理后产品的菌落总数、霉菌及酵母菌经过一段延滞期后迅速上升，最终数量达到与对照组相近的极值，可推断超高压处理对微生物有致伤作用，受伤的微生物在后续保藏过程中表现出复活的现象，仍会生长导致腐败，200 MPa处理5 min与10 min可能对主要腐败菌的致伤作用有限，使其在良好的环境中很快修复；同时在相同压力处理条件下，处理15 min对微生物延滞期的延长及生长速率的降低作用更强，推断处理15 min较处理5 min与10 min对微生物有更强的致伤作用；相同处理时间，压力的升高(200～500 MPa)，使微生物生长延滞期延长，生长速率降低，可能是压力的增加增强了对微生物的致伤作用；大肠菌群除了200 MPa、5 min处理第30 d达到3.0 MPN/g其余处理样始终低于检测限，超高压处理影响了真空包装峰甘板栗贮藏期的菌相构成，但没有改变其主要的腐败菌与longo等[24]研究结果一。

菌落总数、霉菌、酵母、大肠菌群和沙门氏菌表现出对压力处理耐受性的差异，较低压力处理条件即可将大肠菌群全部抑制，霉菌、酵母对压力有一定耐受能力，比菌落总数更敏感。可见超高压处理效果受微生物种类的影响。ANNA等[25]发现600 MPa处理对切片火腿、发酵香肠中大肠杆菌有显著致死效果。YALDAGARD等[26]研究表明200 MPa处理鲑鱼，细菌总数下降30 %，而酵母菌未发生变化，与本试验结果一致。

2.2 峰甘板栗货架期间菌落总数生长模型的建立

根据图1测定的菌落总数计算响应值Y( LgNt/N0)，利用DPS软件对响应值Y及货架时间t进行微生物生长模型拟合，拟合方程及其方差分析如表1所示。

由表1可知，通过F检验，对照组，F=3 387.831 9F0.05(2，1)=199.5，F=756.404 3>F0.05(2，1)=199.5，证明模型可以较好地拟合不同超高压条件处理的峰甘板栗在货架期间菌落总数的动态变化。200 MPa、10 min处理组，F=301.6467>F0.01(2，2)=99.01；200 MPa、15 min处理组，F=318.278 0>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、5 min处理组，F=217.764 8>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、10 min处理组，F=660.704 8>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、15 min处理组，F=593.936 3>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、5 min处理组，F=96.483 9>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、10 min处理组，F=70.952 8>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、15 min处理组，F=77.405 6>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、5 min处理组，F=168.080 9>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、10 min处理组，F=556.840 6>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、15 min处理组，F=305.608 1>F0.01(2，4)=18.00；由此可知，建立的模型在显著水平(a=0.01)内是极显著的；其中R2均大于0.97，说明模型可以解释97%以上试验所得数据，证明模型可以很好的拟合不同超高压条件处理的峰甘板栗在货架期间菌落总数的动态变化。

表1 不同超高压条件处理的峰甘板栗货架期间的菌落总数生长模型及其回归方程方差分析表

续表1

组别方差来源平方和自由度均方F值显著水平500MPa、5min回归1.534520.7673168.0809**剩余0.018340.0046Y=1.3905×exp[-exp(0.9889-0.0827t)]R2=0.9882500MPa、10min回归1.608220.8041556.8406**剩余0.005840.0014Y=1.3899×exp[-exp(1.1650-0.0788t)]R2=0.9964剩余0.010240.0025Y=1.4409×exp[-exp(1.1081-0.0656t)]R2=0.9935

2.3 不同处理组峰甘板栗货架期的计算

以菌落总数1000 CFU/g作为峰甘板栗的腐败货架期标准，根据以上数据及动力学方程(改良Gompertz模型)可得货架期参数如表2。

表2 峰甘板栗4 ℃保藏过程菌落总数生长动力学参数(μ和λ)及货架期

结合图1、图2及表2可知，与对照组相比，超高压力越高，处理时间越长，对生长延滞期(λ)及最大生长速率(μmax)影响越大，进而达到延长货架期目的。相同压力处理条件下，不同微生物对压力的耐受程度不同，大肠菌群对压力处理极为敏感。200 MPa处理10 min及更高压力处理能够将其全部抑制。200 MPa处理5 min使大肠菌群的生长速率降低，但未能完全抑制其生长，其结果与高扬[3]研究结果一致。

2.4 峰甘板栗最低货架期预期

在进行感官质量评定前，根据该试验品特性、消费者调查报告数据及市场商业化要求，其转化为产品的货架期不得低于30 d。

2.5 峰甘板栗的感官质量变化

对达到最低货架期30 d以上及菌落总数不超过标准的真空包装峰甘板栗产品进行感官评价(表3)。

表3 峰甘板栗在不同超高压处理条件下的感官质量评分

由表3可知，高压对峰甘板栗的外形色泽及组织状态影响较大，与对照组相比，经过超高压处理的峰甘板栗外形色泽偏红黄，评分相对低，但在贮藏过程中色泽保持较好；而组织状态随着贮藏时间增长逐渐变软；300 MPa对峰甘板栗的色泽影响较大，而400 MPa对其气味滋味影响较大，500 MPa对其组织状态与外形色泽影响都较大；感官数据结合动力学货架期，可知300 MPa处理最佳。

超高压对草莓[27]、莴笋[2]、鲜切苹果[28]、鲜荔枝[29]、石榴果泥[30]的研究表明，不同高压对风味物质的保留、产品的机械损伤及膜氧化损伤、硬度与色泽都有不同的影响。故不同高压对峰甘板栗感官指标的影响需进一步研究机理。

3 结论

(1)超高压压力水平的提高与处理时间的延长增强了对峰甘板栗主要微生物的杀灭和抑制效果，在一定范围内超高压处理强度是压力水平和处理时间的函数，而压力水平是抑制效果的最主要影响因素。

(2)峰甘板栗中菌落总数、霉菌酵母、大肠菌群和沙门氏菌表现出对压力处理耐受性的差异，较低压力处理条件即可将大肠菌群全部抑制，霉菌酵母对压力有一定耐受能力，比菌落总数更敏感。可推断超高压处理效果受微生物种类的影响。

(3)超高压处理对微生物有致伤作用，受伤的微生物在后续保藏过程中表现出复活的现象，仍会生长导致腐败。试验中压力的升高(200～500 MPa)，使微生物生长延滞期延长，生长速率降低，推断可能是压力的增加增强了对微生物的致伤作用。

(4)超高压处理200 MPa达不到延长货架期至30 d的效果；300 MPa处理对峰甘板栗的色泽有影响，但综合评价，300 MPa处理最佳；400 MPa处理峰甘板栗其气味滋味发生明显的变化；500 MPa对峰甘板栗的组织状态影响较大。

(5)试验建立的Gompertz模型拟合程度较高，结合感官质量评定结果，确定300 MPa处理15 min最佳可延长货架期至38 d。

4 展望

实验中建立的Gompertz模型能有效拟合不同超高压处理的峰甘板栗的菌落总数的动态变化，结合修正Gompertz动力学方程，可以预测达到微生物限量时4 ℃峰甘板栗的货架期，保证峰甘板栗的贮藏安全性。但是微生物生长的初级模型只是模拟了微生物生长与时间之间的近似关系，由于微生物在食品中的生长与所处的环境条件有极大的关系，所以有必要在初级模型中引入环境因子对微生物生长的影响，应用预测微生物学的二级动力学模型。

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Effect of ultra-high pressure on microbial population and prediction to shelf-life of vacuum-packaged Feng Gan Chestnut during 4℃ storage

GUO Hao-ning1, ZHAO Yu-hua1,2,3, CHANG Xue-dong1,2,3*, LI Cong1, YAO Yuan1

1(Hebei Normal University of Science and Technology, Changli 066600 China) 2(Chestnut Engineering Research Center of Hebei, Changli 066600 China) 3 (Yanshan Special Agricultural Technology Industry Research Institute of Hebei, Changli 066600 China)

Vacuum-packaged Feng Gan Chestnut were subjected to ultra-high pressure treatments at 16-18 ℃ and different pressure levels:200, 300, 400 and 500 MPa for 5 or 10 or 15 min before storage at 4 ℃ for 60 days with the aim of investigating the effect of ultra-high pressure on the microbial population and sense, then establishing the microorganism growth model to imitate the shelf life of vacuum-packaged Feng Gan Chestnut. Compared with control samples without receiving any sterilization treatment, ultra-high pressure treatment could dramatically reduce initial microbial count in Feng Gan Chestnut, and inhibit the growth of dominant spoilage bacteria including total bacteria, yeast, mold and coliforms, which was positively related to pressure (200-500 MPa) and length of treatment time (5-15 min). The test indicated that the Gompertz model could effectively imitate the dynamic change of number of bacteria during different storage treatment and the growth model could be used as a tool to powerfully evaluate shelf life and tissue damage. Ultra-high pressure treatment at 500 MPa for 5, 10 and 15 min could prolong the shelf-life of vacuum-packaged Feng Gan chestnut from 9 to over 60 days during 4 ℃ storage. Combined with the sensory quality evaluation results, Ultra-high pressure treatment at 300 MPa for 15 min was best that could prolong the shelf-life from 9 to 38 d.

ultra-high pressure(UHP)；vacuum-packaged；spoilage microorganism；shelf-life

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610031

硕士研究生(常学东教授为通讯作者，E-mail：cxdspx@163.com)。

林业公益性行业科研专项经费项目(201304708)

2016-03-31，改回日期：2016-06-04