Au/TiO2纳米复合物增强可植入式葡萄糖传感器

刘洋，邹斌，钱鲲，王亚衡，屠一锋*

（1.武警总医院药剂科，北京100039；2.苏州大学材料与化学化工学部，江苏苏州215123；3.江苏宏锦天药业有限公司，江苏泰州225300）

Au/TiO2纳米复合物增强可植入式葡萄糖传感器

刘洋1，邹斌2，钱鲲2，王亚衡3，屠一锋2*

（1.武警总医院药剂科，北京100039；2.苏州大学材料与化学化工学部，江苏苏州215123；3.江苏宏锦天药业有限公司，江苏泰州225300）

将Au/TiO2纳米复合材料修饰在针型Pt电极上，用戊二醛作为交联剂将葡萄糖氧化酶固定在此修饰电极上，然后在酶电极上以5%Nafion乙醇溶液涂膜形成高分子膜保护层，制成可植入使用的葡萄糖传感器。采用三电极体系，考察了该传感器的检测能力。实验结果表明，该传感器的检出限为3.0×10-6mol·L-1，线性范围为1.0×10-5～1.0× 10-3mol·L-1。研究表明，将纳米材料应用于葡萄糖传感器，成功地提高了灵敏度。还考察了影响传感器酶活性的部分因素。该传感器作为一种可植入器件的雏形，有望发展成有实际应用前景的临床检测装备。

血糖；植入式；传感器；葡萄糖氧化酶；Au/TiO2纳米复合物

定期血糖监测可以提示糖尿病患者的血糖变化，对生活规律、运动、饮食以及合理用药都具有重要的指导意义[1-2]。临床上通常要求每天监测四次（三餐前，睡前）或七次（三餐前，三餐后2 h，睡前）来了解血糖变化情况，但是因为测量次数较多，给病人的正常工作和生活带来极大的不便，也并不能真实地反映患者血糖的波动情况，而且频繁的针刺采血也带来较大的感染风险。20世纪90年代以来，血糖监测研发的焦点逐步集中于发展微创的可植入设备上[3]，国外已经有可植入式动态血糖传感器[4]问世，并用于血糖的连续监测控制自动胰岛素泵。连续动态血糖检测仪可以更好地指导临床用药，必将大幅提高糖尿病的治疗效果[5]。从病理上说，糖尿病本身对病人生命不产生直接的威胁，只要控制好血糖水平，诸多并发症如大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等得以防止，则糖尿病人的生活质量可以得到很好的保证。因此，性能优越的并可实施动态连续监测的植入式葡萄糖传感器十分必要。但是，动态血糖检测在技术上还不成熟，仍需利用静脉或末梢血糖值加以校正[6]，而国内这方面研发工作则比较缺乏。

现有的血糖传感器主要是葡萄糖生物传感器[7]，各种葡萄糖生物传感器的工作原理大体相仿，基本以葡萄糖氧化酶（GOD）作为生物识别单元，以电化学方法检测酶催化反应生成的H2O2[8]，研究方法与性能上的差异主要在于对H2O2的检测。随着对纳米材料研究的不断深入，制备纳米金属氧化物及复合金属氧化物粉体技术不断发展和成熟[9]，对纳米材料修饰电极的研究及其应用也越来越受到关注[10-11]。该研究合成了一种负载型的Au/TiO2纳米复合物[12]，通过一系列表征手段证实Au是以原子簇的形式分布于纳米TiO2的表面，该纳米复合物有较好的对化学分子氧化还原的催化作用。该研究利用纳米复合材料功能化针形Pt电极，其对H2O2氧化还原具有良好的促进作用，并以此为基础研制了一种微创的可植入型葡萄糖传感器。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

纳米TiO2（南京海泰纳米有限公司，中国），氯金酸、二水合柠檬酸三钠、乙醇、氨水、戊二醛、H2O2等均为

分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司，中国）；Nafion（阿法埃莎中国化学有限公司，中国）。葡萄糖氧化酶（GOD，10KU，Sigma，美国）；牛血清蛋白（BSA，Fluka，美国）；pH＝7.0的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液。实验用水为超纯水。RST600电化学工作站（苏州瑞斯特科技有限公司，中国），测试系统为三电极体系，针形铂电极（φ＝0.3 mm）为工作电极，甘汞电极为参比电极，另一支铂电极为辅助电极。UV-3600 UV-Vis-NIR光谱仪（岛津，日本）。

1.2 Au/TiO2纳米复合物及修饰电极的制备

纳米复合材料的制备：取一定量的混晶型纳米TiO2粉末于三颈烧瓶中，加入50 mL 1×10-4g·mL-1HAuCl4溶液，在超声仪中超声分散5 min。将烧瓶置于130℃油浴中加热回流并匀速搅拌。当烧瓶中混合液完全沸腾时，迅速沿烧瓶壁加入一定量1×10-2g·mL-1柠檬酸钠溶液，同时剧烈搅拌，瓶中混合液由乳白色变为淡紫色。继续加热搅拌15 min后停止，静置，直至完全冷却。所制备的复合纳米材料的电子显微图像见图1，可明显观察到Au纳米颗粒沉积于TiO2颗粒表面。

图1 材料的透射电镜图像

该材料的漫反射紫外可见吸收光谱见图2，从该图上可明显观察到TiO2的吸收峰发生了约20 nm的红移，表明其半导体性能有所改变。一般意义上说，吸收光谱发生红移对应半导体材料的禁带宽度减小，从而有更多电子从价带跃迁到导带，不仅使材料的导电性有所提高，而且催化性能也得以增强。

修饰电极制备：将针形铂电极粗糙处理、清洗干净并且超声5 min，干燥后在上述Au/TiO2纳米复合物分散液中采用提拉法均匀蘸满分散液，置于红外灯下烘干约2 h。

图2 材料的漫反射紫外可见吸收光谱

1.3 葡萄糖传感电极的制备

将20 mg GOD，15 mg BSA，0.5 mL pH＝7的缓冲液搅拌均匀，置于冰箱保存。取0.1 mL上述混合液和0.1 mL 5%戊二醛迅速混合，将Au/TiO2修饰电极浸入混合液中，待溶液蘸满电极后取出，置于阴凉通风处，直至完全风干，形成一层含酶的薄膜。然后将此电极浸入5%Nafion乙醇溶液后提出，待其风干后形成保护层。

2 结果和讨论

2.1 Au/TiO2纳米复合物的优化及催化性能

纳米复合物中TiO2与Au的质量比对其性能有重要而直接的影响，实验中通过调整HAuCl4和TiO2的投料比改变其最终质量比。为得到合成产物中Au的实际含量，将合成的纳米复合物旋转蒸发以除掉溶剂，得到紫色的纳米复合物固体并经干燥得到粉末，用少量王水浸泡粉末将复合物中的Au溶解到王水中，稀释定容后用原子吸收光谱测定Au的含量。研究结果表明，当Au和TiO2的质量比为1∶170时，该纳米复合物具有最大的催化活性。柠檬酸钠作为还原剂和保护剂，其用量对氯金酸的还原以及所生成纳米金的粒径大小、分散性，以及与TiO2的相互作用都有重要影响，因此，实验中对柠檬酸钠的使用量进行了优化，结果表明2倍于HAuCl4质量的柠檬酸钠可实现最好的效果。

以上述合成的Au/TiO2纳米复合物修饰针形Pt电极，采用计时电流法（设定电位400 mV）测定H2O2，结果见图3，检出限可达到1.0×10-7mol·L-1（裸电极为1×10-6mol·L-1），且所需电位较低（裸电极需700 mV），表现出明显的优势。

该纳米功能化电极对H2O2有较为灵敏的响应，其原因在于Au/TiO2纳米材料的应用。如前文述及，在TiO2纳米材料表面沉积Au后，减小了禁带宽度，从而使更多的电子跃迁至导带，在材料表面存在较多的e/h+对，对吸附于材料表面的分子的氧化还原具有显著的催化作用[13]。而经由酶催化反应产生的H2O2即在纳米材料的催化下发生快速的氧化还原反应，因此，得到较大的响应电流。

2.2 酶电极的响应特性

以该酶电极测定葡萄糖，从计时电流曲线（图4）可以明确得到随葡萄糖的加入而产生的电流变化，该响应具有良好的线性，其线性回归方程为：i（μA）＝0.02+0.009Cglucose（μmol·L-1），线性相关系数r＝0.999，该传感器的响应线性范围为1.0×10-5～1.0×10-3mol·L-1，检出下限为3.0× 10-6mol·L-1。

图3 Au/TiO2修饰电极上H2O2的计时电流响应

2.3 传感器活性的影响因素

考虑该传感器未来主要用于在体的血糖连续监测，研究中考察了可能影响传感器活性的因素，对于人类而言，正常的饮食不会导致体内生理成分的大幅度变化，而唯有大量饮酒可能导致体液内乙醇浓度的较大幅升高，因此，重点考察了乙醇对传感器活性的影响，结果见图5。

图4 传感器对葡萄糖的计时电流响应

图5 乙醇对传感器活性的影响

由图5可知，高浓度乙醇确实会导致酶的失活从而使传感器完全失效。但这种失效发生在高浓度乙醇高温长时间处理条件下，正常人体条件完全不可能出现这种情况，这预示该传感器有较好的活性保持能力，笔者认为这应该得益于保护膜的应用。Nafion®是聚四氟乙烯（Teflon®）和全氟-3，6-二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物[14]，Nafion的主要作用是靠膜内部亲水性的离子化磺酸基聚集溶剂分子，以提供亲水性的生物相容的界面和空间。Nafion十分稳定，一般情况下不会发生任何化学变化，热稳定性高达160℃，因而可以提供合适的微环境保护酶的活性。

3 结语

基于Au/TiO2纳米复合物膜构建的葡萄糖传感器的检出限为3.0×10-6mol·L-1，线性范围为1.0×10-5～1.0× 10-3mol·L-1。一般情况下，血液中的葡萄糖浓度在1～25 mmol·L-1范围内，该研究开发的传感器是预期植入皮下组织中进行葡萄糖检测，而皮下组织中的葡萄糖浓度较血液中为低，故可认为该传感器具有实际应用的可能。同时，研发该传感器应用的是φ＝0.3 mm的针形Pt电极，这是考虑了皮肤组织的痛觉阈值，目前国内尚无如此小尺寸的葡萄糖传感器的研究报道。由于该传感器的研发目标是植入式动态监测，目前尚不具备进行实际人体检测应用的条件。

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An Au/TiO2nanocomposite enhanced biosensor for embedding glucose monitoring

LIU Yang1，ZOU Bin2，QIAN Kun2，WANG Yaheng3，TU Yifeng2
（1.Department of Pharmacy，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China；2.College of Chemistry，Chemical Engineering and Material Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Jiangsu Hongjintian Pharmaceutical Co.Ltd.，Taizhou 225300，China）

Based on the modification of Au/TiO2nanocomposites on a Pt needle electrode，we fixed the glucose oxidase on it by BSA and glutaraldehyde as the cross-linker.A glucose biosensor was fabricated by coating with 5%Nafion to act as a polymer preserving layer.The resulted embeddable glucose biosensor was tested for evaluation of its detection performance.The experimental results show that the linear range of this biosensor is 1.0×10-5to 1.0×10-3mol·L-1with a detection limit of 3.0×10-6mol·L-1.The sensitivity of this needle sensor is promoted by nanomaterials.In addition，the factors affecting the enzyme activity of this biosensor were discussed.As a prototype for implantable usage，the resultant sensor is promising used as a clinical assay device.

blood glucose；embedment；biosensor；glucose oxidase；Au/TiO2nanocomposite

O657.1

A

1672－0687（2016）04－0048－04

责任编辑：李文杰

2016－04－05

国家自然科学基金资助项目（21375091）

刘洋（1974-），女，副主任药师，硕士，研究方向：药物制剂与临床药学。

*通信联系人：屠一锋（1963-），男，教授，博士，博士生导师，E-mail：tuyf@suda.edu.cn。