适配体传感器在农药残留检测中的应用

白文荟，陈爱亮

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所,北京 100081)



适配体传感器在农药残留检测中的应用

白文荟，陈爱亮*

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所,北京 100081)

基于脱氧核糖核酸的生物检测技术在食品中有毒有害物质检测方面发挥着日益重要的作用。其中，作为一类具有良好应用前景的分析工具，以适配体技术为基础的快速检测方法与传统检测方法相比，具有简单便携、响应迅速、灵敏度高、特异性好、成本低等显著优势，因此在近些年成为分析检测领域研究的热点之一。该文总结了近几年应用于食品安全特别是农药残留检测的几种适配体检测技术(包括比色法、荧光法以及电化学法)，并对其检测特点及应用进行了介绍。

适配体；农药残留；检测；综述

目前，我国的食品安全形势不容乐观，相当一部分农畜产品中的有毒有害物质残留超标，重金属、水污染及农药污染严重。这不仅影响了人民群众的身体健康和生命安全，也极大程度地影响到我国农业的可持续发展。农业生产在施药后，农药在农作物、蔬果、土壤、大气、环境水中长期残留，不仅会造成环境污染等问题，还会经由食物链的富集作用，最终进入人体，对人体健康造成极大危害，除急慢性中毒外，“三致”作用、诱发癌症等也是农药残留不可忽视的潜在危害。目前使用的农药种类主要包括有机磷类、有机氮类、拟除虫菊酯类农药。其中有机磷农药属于高毒性农药，也是我国目前在用杀虫剂的主要种类[1-2]，其主要的危害机理是能够抑制动物体内的胆碱酯酶活性，尤其是抑制乙酰胆碱酯酶，从而引起神经递质乙酰胆碱的累积，造成神经功能的紊乱[3-4]。有机氮类农药包括氨基甲酸酯类、脒类、酰胺类等多种含氮有机化合物，并以氨基甲酸酯类农药的使用最为广泛，此类农药在环境中较易分解，大多数属于低毒性农药，但仍具有一定程度的慢性毒性[5]，其毒性机理与有机磷农药相似，但对胆碱酯酶抑制作用的时间较短[6]。脒类农药(如啶虫脒)的主要毒性则为神经毒性，急性中毒主要损伤心血管系统，慢性中毒会造成神经衰弱、诱发癌症等[7]。

1 农药残留检测研究现状

目前农药残留检测常用的方法主要有传统的仪器检测法以及酶抑制法、免疫分析法、生物传感器法等快速检测方法。

1.1 常规仪器检测法

利用精密的大型仪器如质谱或色谱等检测农药残留，仍是目前农药残留的主要定量检测方法。薄层色谱 (Thin layer chromatography,TLC)法是色谱法中应用最早、最为广泛的一种微量检测方法，检出限可达0.1～0.01 μg[4]。近年来，薄层色谱法与酶抑制法、荧光显色技术等结合能检测显色法无法或不易检出的某些农药，并且大大提高了某些农药的检出限[8]。气相色谱(Gas chromatography,GC)法可一次测定多种成分，具有选择性好、效能高、灵敏、快速、应用广、样品用量少、仪器造价低、能同时分离分析多组分混合物、易于自动化等特点，在农药残留定量分析中的应用最为广泛[9]。选择合适的检测器类型是应用GC有效测定农药残留的关键，主要用于有机磷农药残留检测的两种检测器类型是火焰检测器(Flame photometric detector,FPD)[6-12]和氮磷检测器(Nitrogen and phosphorus detector,NPD)[9-15]。与经典液相色谱相比，高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法的分离效率高，分离速度快，灵敏度高，同时可以测定高沸点、热不稳定、易裂解变质等不宜用气相色谱法测定的相对分子量较大的化合物[16-17]。但高效液相色谱法有机溶剂用量大、前处理过程复杂的缺点不可忽视。质谱(Mass spectrometry,MS)法在多残留定性定量分析检测中具有显著优势，常与色谱法联用，如GC-MS[18-22]，GC-MS/MS[23]以及液相色谱-串联质谱(Liquid-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[24-26]的应用，均进一步推动了农药残留分析技术的发展。

1.2 常见快速检测法

传统的仪器检测方法普遍存在前处理过程复杂、耗时费力、检测成本高、需专业人员等不足，无法满足快速筛查及普及应用的需要。目前常见的农药残留快速检测方法主要包括酶抑制法、免疫分析法和生物传感器法等。

酶抑制法是应用最为广泛的农药快速检测方法[27-29]，该方法简便、灵敏、成本低，十分适合现场快速检测和批量样品筛查检测。其主要原理是基于有机磷农药和氨基甲酯类农药对乙酰胆碱酯酶(AChE，Acetylcholinesterase)催化水解功能的抑制作用，且抑制程度与有机磷农药的浓度呈正相关。目前市面上常见的农药速测卡大多基于酶抑制法的检测原理。

酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme linked immunosorbent assay)是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析技术，具有特异性强、灵敏度高(检出限可达1 μg～1 pg)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点[30]。近年来，国内外已研究开发出杀虫剂、杀菌剂、除草剂等40余种农药的酶免疫分析方法[31]，且用于田间快速测定的酶免疫分析试剂盒也已商品化。

生物传感器是一类特殊的化学传感器，由生物识别元件(如酶、微生物、抗体等)和物理转换器相结合所组成，生物部分产生的信号可转换为光、电、声等信号而被检测，对靶标具有高度选择性，可在复杂体系中进行在线、快速、连续监测[32]。应用于农药检测的传感器主要有基于酶抑制原理的胆碱酯酶传感器以及基于水解原理的有机磷水解酶传感器，随着现代分析技术的不断发展，近年来，光导纤维、压电晶体、半导体器件型生物传感器也相继出现，为农药检测提供了新途径[4]。

近几年也不断涌现其他快速检测方法，如分子印迹技术(MIT，Molecular imprinting technology)、噬菌体展示技术(PDT，Phage display technology)等，引起了广泛关注。应用 MIT 制备的分子印迹聚合物(MIPs，Molecularly imprinted polymers)具有特定识别性、化学稳定性和广泛适用性等优点[33-35]。采用分子印迹膜(MIM，Molecularly imprinted)代替已有的传感器识别元件，提高了传感器的灵敏度、稳定性和选择性，且价格低。Bakas等[33]基于分子印迹技术建立了乐果的分子印迹固相萃取方法，成功用于橄榄油中乐果的分离提取，之后采用高效液相色谱法检测，灵敏度可达0.012 μg/g。此后，该课题组利用分子印迹固相萃取方法成功分离提取了橄榄油中的倍硫磷[34]，与传统的C18提取柱相比分离效率显著提升，结合高效液相色谱检测，检出限可达5 μg/L。Duan等[35]结合分子印迹技术建立了乙酰甲胺磷的电化学检测方法，检出限可达0.13 μmol/L。噬菌体展示技术则是在噬菌体表面将外源蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白融合，用于改造和筛选功能性多肽的生物技术，具有结合特性强、易于筛选等特点[36]，但由于噬菌体展示系统依赖细胞内基因表达，一些对细胞有毒性的分子很难得到表达和展示。目前只有Jiang等[36]利用噬菌体展示技术针对二甲基类的有机磷农药进行了相应抗体制备的研究，并成功建立了非竞争性的免疫检测体系，方法检出限可达10.54 μg/L。

2 适配体技术在农药快速检测中的应用

近几年，基于脱氧核糖核酸(DNA)的生物检测方法研究也在持续升温，应用领域逐渐涉及分子诊断[37-40]、药物基因组学[41-42]、药物筛查[43-45]、食品分析[46]、农药及环境污染物监测[47-49]等。核酸适配体是指可与待测靶标特异性结合的单链寡聚核苷酸链。适配体具有筛选简单、靶标物质范围广、亲和性与特异性高、稳定性强和易修饰等优点，与目前应用更为广泛的抗体、酶等生物传感元件相比，制备难度更低、生物稳定性更优、生物依赖性更小，在快速分析检测领域的应用前景非常广阔。随着近几年适配体技术的不断发展，在农药残留分析检测方面，已成功筛选或设计了若干条对几种特定农药具有高度亲和性与特异性的适配体核酸序列，并在此基础上成功建立了包括比色法、荧光法、电化学法在内的农药残留快速检测方法(见表1)，进一步推动了食品安全快速检测技术的发展。

表1 农药适配体的应用

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2.1 比色法

一直以来，基于纳米材料(例如纳米金、纳米银等)的比色法作为一类灵敏直观的检测手段，因其检测原理简单且无需特别的专业操作技术，通过纳米颗粒的团聚所表现出的体系颜色变化即可直观便捷地实现对目标物的快速检测，因此在分析领域的应用非常广泛。目前，比色法已成功应用于多种类型目标物的检测分析，包括核酸[62]、蛋白质[63]以及金属离子[64]等小分子量靶标[65]，基于光谱法原理的适配体传感器在农药残留检测方面的研究也有不少进展。

Pang等[51]通过将巯基化的适配体偶联在纳米银颗粒表面借助表面增强拉曼光谱平台(SERS，Surface enhanced Raman spectroscopy)实现了4种有机磷农药的同时检测。该方法的检测原理如图1A所示：首先，将特异性适配体通过巯基作用偶联于纳米银颗粒表面，形成Ag-Apt；然后，向该混合体系中加入6巯基乙醇(MH)避免非特异性结合，混合孵育后形成[Ag-(Apt+MH)]复合物，该复合物结构能够特异性捕获磷酸基团(P)；最后加入待测目标物，混合孵育后离心去除上清液获得[Ag-(Apt+MH)-P]结构复合物，重溶蒸发干燥后即可用于光谱检测。该方法中4种有机磷农药靶标水胺硫磷、氧乐果、甲拌磷、丙溴磷的检出限分别可达1，5，0.1，5 μg/mL，并成功应用于苹果汁样品的检测。方法中的适配体可以特异性地捕捉4种有机磷农药，文中也提出了利用特定适配体检测更广范围的有机磷农药的想法。本课题组在此基础上，首次建立了基于适配体纳米金比色技术的6种有机磷农药的快速检测技术[52]。首先单链DNA适配体可吸附于纳米金颗粒表面，保护其在高盐浓度溶液下仍保持红色，且不发生团聚；向表面吸附着适配体的纳米金溶液中加入相应的靶标后，对适配体具有高亲和力的靶标与纳米金颗粒竞争性结合适配体，形成适配体-靶标复合结构，使起保护作用的适配体从纳米金粒子表面解离；再向反应体系中加入一定浓度的盐溶液后，可使失去保护的纳米金颗粒在盐离子作用下团聚，溶液变为紫色或蓝色，并且纳米金溶液的变色程度与靶标浓度呈正相关。利用该方法检测水胺硫磷的检出限可达0.1 μg/mL，而伏杀硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、敌百虫、毒死蜱5种有机磷农药的检出限则为2 μg/mL，并成功应用于河水样品的检测。虽然方法的灵敏度有待提高，但与现有最常用的仪器检测方法相比省去了复杂的样品前处理过程以及对人员和技术的严苛要求；与Pang等[51]的拉曼光谱检测法相比，本课题组建立的检测方法体系更为简单，操作更为便捷。Liu等[53]根据靶标灭蝇胺的结构特性设计了一段高亲和性适配体(polyT10)，建立了一种高灵敏度的基于polyT10和纳米金的比色法检测灭蝇胺，检测原理见图1B：自由卷曲的单链polyT10可以吸附在纳米

金上保护其在盐存在时不团聚变色，而当加入靶标灭蝇胺时，polyT10与其通过氢键结合导致其从纳米金表面解离，失去了保护的纳米金在盐存在时变蓝，从而实现对灭蝇胺的检测。该方法的LOD和LOQ分别为252 ng/g和500 ng/g，符合我国对灭蝇胺在蔬菜中的最大残留限量要求(MRLs)，并在黄瓜中得到成功应用。Shi等[55]利用啶虫脒的高亲和力适配体建立了纳米金比色法(图1C)，线性范围为75 nmol/L～7.5 μmol/L，最低检出限可达5 nmol/L，并在土壤样品中成功应用。特别指出的是，该条啶虫脒适配体的特异性非常好，即使加入啶虫脒的结构类似物吡虫啉和毒死蜱，该方法仍表现出极好的特异性。Kwon等[56]成功筛选出异稻瘟净和克瘟散的高亲和力适配体，并建立了基于适配体纳米金比色原理(图1D)的多重靶标检测体系，实现大米样品中异稻瘟净和克瘟散的高灵敏检测，检出限分别为1.67 μmol/L和38 nmol/L。

2.2 荧光法

荧光分析法是以荧光探针与生物大分子结合后的荧光特性、电化学特征、动力学特征等为基础而建立的一类检测方法，其测定机理是待检分子对探针分子荧光强度的影响。与其他光学检测技术相比，荧光分析法具有灵敏度高、选择性好等突出优点；且具有多种测定参数，如荧光寿命、荧光量子产率等；多种检测技术，如同步荧光、共振荧光、荧光动力学分析法等[66]。随着荧光技术的不断发展，荧光分析不再局限于一些强荧光物质的分析，还可以利用“荧光探针”技术即某些试剂与非荧光或弱荧光物质以共价或其他形式结合形成发荧光的络合物或聚集体进行测定，对无荧光或弱荧光的物质进行分析[66]。近几年，与适配体相结合的荧光分析技术得到了很大发展。

Zhang等[57]利用分子信标(Molecular beacon，MB)和适配体建立了一种有机磷农药的荧光检测方法，并对甘蓝样品进行了加标检测。该方法的检测原理(图2A)：具有特定发夹结构的分子信标和靶标物质对特定的适配体序列存在竞争性结合，这种MB在其发夹结构两端分别标记有1个荧光基团和1个荧光猝灭基团，单独存在时处于荧光猝灭状态；当体系中加入适配体后，二者的互补序列即可发生碱基互补配对，原本相邻的荧光基团和猝灭基团因空间距离的增加使得荧光信号释放，此时可检测到较强的荧光信号；在加入靶标时，与靶标具有高度亲和力的适配体会部分从MB-适配体复合结构上发生解离，从而使部分MB恢复可使荧光猝灭的发夹结构，此时体系可检测到的荧光信号与之前相比有所降低，且降低程度与加入靶标的浓度呈正相关，从而实现对靶标的定量分析。利用该方法检测甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果的检出限分别为19.2，13.4，17.2，23.4 nmol/L，与Pang等[51]建立的这4种有机磷农药的光谱检测法相比灵敏度有了很大程度的提高，说明荧光检测法具有更加灵敏的优势。Dou等[58]利用纳米金构建了一个检测原理类似的纳米探针，利用相似的原理(图2B)检测了上述4种有机磷农药，该方法检测甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果的检出限分别为0.384，0.134，0.035，2.35 μmol/L，虽然检测的灵敏度不及MB，但在有效降低背景干扰方面优势显著。Tang等[59]首次将可以特异性识别4种有机磷农药的广谱适配体与量子点技术结合，基于毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)技术建立了4种有机磷农药的高灵敏检测方法，检测原理如图2C所示：首先，羧基修饰的量子点(QD)可与适配体的互补序列(AMO)末端的氨基以酰胺键形成QD-AMO结构，无待测靶标存在时，该结构可与适配体进一步结合形成线性的带有部分双链的复合物；加入靶标后，适配体与靶标以更高亲和力结合，QD-AMO-Apt复合物双链结构解离，导致之前的线性结构发生折叠，变为两种复合结构QD-AMO和适配体-靶标复合物。随着靶标浓度的变化，QD-AMO和QD-AMO-Apt的荧光峰高比会发生规律性的变化，变化的结果可利用毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)技术进行检测，进而实现对目标物的定量分析。利用该方法检测苹果皮中甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果的检出限分别为0.20，0.10，0.17，0.23 μmol/L。Lin等[60]用经ZnS∶Mn量子点修饰的啶虫脒适配体，结合纳米金和多壁碳纳米管(MWCNTs)建立了一种荧光检测方法(图2D)：首先，将经过量子点修饰的适配体固定在纳米金颗粒上，该方法中使用的MWCNTs具有猝灭量子点荧光的作用，在体系中只有纳米金-适配体和MWCNTs存在的情况下，荧光被猝灭，能检测到的荧光信号大幅度下降；加入啶虫脒后，纳米金-适配体复合物会与靶标特异性结合，从而使体系荧光得以恢复，并且恢复的程度与靶标浓度呈正相关。该方法对啶虫脒的检测线性范围为0～150 nmol/L，检出限可达0.7 nmol/L，并在河水和菜叶等实际样品中验证了方法的有效性。

2.3 电化学法

图3 检测啶虫脒的电化学传感器的构建和原理示意图[61]Fig.3 Schematic of a highly selective electrochemical impedance spectroscopy-based aptasensor for sensitive detection of acetamiprid[61]

电化学适配体传感器作为一类极具发展潜力的分析工具，因具有便携性好、响应迅速、灵敏度高、特异性好以及检测成本低等优点，在近几年的食品安全检测领域的研究中时有报道。在预先经过表面功能活化的电极表面固定化修饰针对特定靶标的核酸适配体，表面功能化策略的选择会直接关系到电化学传感器的活化区域面积，进而影响适配体固定化的效果，因此，固定化策略应尽可能降低位阻现象的影响[67]。目前适配体结合电化学技术检测农药的文献报道仅Fan等[61]针对啶虫脒建立了基于电化学阻抗谱分析(EIS)的电化学检测方法。其基本原理(图3)：首先，将纳米金粒子通过电沉积作用修饰在裸金电极表面，这层纳米金颗粒一方面可作为后续固定适配体的载体，另一方面还可提高适配体的灵敏度；然后，将巯基化的啶虫脒适配体通过与纳米金粒子的偶联作用固定在电极上的纳米金颗粒层，即完成电化学传感器的构建。当加入啶虫脒时，啶虫脒-适配体复合物的形成会引起电子转化电阻的增加，且增加的程度与靶标浓度正相关，从而实现对啶虫脒的高灵敏、高特异性检测。该方法经过污水和番茄实际样品的验证，检出限可达1 nmol/L，线性范围为5～600 nmol/L。针对其他农药的电化学适配体传感器尚处在研究阶段，未见有相关文献报道。

3 结论与展望

与很多兽药都有ELISA试剂盒或试纸条不同，农药的种类数量众多，且大部分农药的分子量较小，难以制备抗体，所以基于免疫分析的农药快速检测方法及产品非常少。虽然有机磷及氨基甲酸酯类农药可用酶抑制法达到快速检测目的，但由于胆碱酯酶活性不稳定，造成该方法的精密度及准确度无法满足实际应用，因此面对数量众多的农药残留亟待开发一种新的快速检测方法。

适配体作为一类新型分子识别元件，具有与抗体类似的亲和力与特异性，但相对于抗体的动物体内制备，适配体是在体外筛选获得，因此适用于任何靶标，为筛选众多农药的特异性识别元件提供了解决方法。同时基于适配体的检测技术也比传统的免疫比色法更具优势，首先其核酸性质使其可以利用杂交、扩增以及特异核酸酶等开发各种超灵敏的检测方法，另外适配体和靶标结合前后其构象会发生变化，利用这一性质可开发出多种turn-on或turn-off的无需洗涤等步骤的均相检测方法。这种简单、快速、灵敏的优势使得适配体分析技术日益受到重视，在构建新型生物传感器的研究中愈加发挥着重要的作用，具有非常广阔的应用前景。

适配体虽然已在农药残留检测领域有所应用，但还有很多技术难点需要克服。首先，目前已筛选到的亲和性及特异性均经过验证的有效适配体数量太少，检测方法开发的局限性较大，需进一步加强农药适配体的筛选工作，或者从改造现有的适配体入手，如片段化或者寻找核心序列等，又或者根据靶标性质自行设计适配体[49]，从而获得更多特异性及亲和力更好的农药适配体；其次，目前建立的快速检测方法存在灵敏度待提高、体系稳定性待增强以及基质干扰影响较大等问题，需进一步优化检测体系及基质样品的前处理方法；最后，亟需开发新的更稳定和更实用的基于适配体的快速检测方法，比如目前在食品安全快速检测领域广受青睐的试纸条技术，将其简便、快速、实用的特点与适配体技术结合，有望成为将来农药残留速测的发展方向。总之，在大量农药难以制备抗体而缺乏快速检测方法的情况下，基于适配体的快速分析技术为农药残留快速检测方法的研发提供了新思路，相信在不久的将来，基于适配体技术的分析检测方法会在农药检测领域占据更加重要的位置。

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Applications of Aptasensor in Determination for Pesticide Residues

BAI Wen-hui,CHEN Ai-liang*

(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

DNA based biosensors have become increasingly important in hazardous and toxic substances detection.Particularly,the aptamer-based methods have been intensively investigated as potential analytical tools providing desired portability,fast response,high sensitivity and specificity in addition to lower cost against classical methods.Some of the techniques for detection of aptasensors(including colorimetric,fluorescent and electrochemical assays) in the last few years were summarized,and their detection characters and applications were discussed.

aptamer；pesticide；residues；detection；review

2016-04-19；

2016-06-22

公益性行业(农业)科研专项资助(201203023)

综 述

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.026

O657；F767.2

A

1004-4957(2016)10-1360-09

*通讯作者：陈爱亮，博士，副研究员，研究方向：食品安全快速检测技术,Tel：010-82106557，E-mail：ailiang.chen@gmail.com