响应面法对3,5-二硝基水杨酸比色法测定水果中还原糖含量条件的优化

李志霞，聂继云，闫 震，李 静，匡立学，沈友明

(中国农业科学院果树研究所，农业部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，辽宁 兴城 125100)



响应面法对3,5-二硝基水杨酸比色法测定水果中还原糖含量条件的优化

李志霞，聂继云*，闫 震，李 静，匡立学，沈友明

(中国农业科学院果树研究所，农业部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，辽宁 兴城 125100)

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定水果中还原糖的含量，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析法(RSM)优化DNS法测定苹果还原糖的最佳条件，同时建立数学模型并验证其可靠性。回归方程失拟项不显著(P=0.133 7)，预测值与实际值吻合(R2=0.957 4)；影响DNS法测定还原糖含量的因素主次顺序为：DNS用量﹥反应温度﹥显色时间；DNS法测定还原糖含量的最佳条件为：DNS用量4.0 mL，显色时间5.0 min，反应温度87.0 ℃，测得还原糖实际浓度为94.66 mg/L，与理论预测值基本相符。按照优化的最佳条件，以苹果、桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝6种代表性水果为对象验证该方法的精密度、重复性和准确度，其标准偏差为0.1%～0.5%，相对标准偏差为2.0%～4.8%，加标回收率为90.6%～104.2%。该方法简便、快速，准确度高，重现性好，适合于苹果及其他水果中还原糖的测定。

还原糖；响应面法；3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法；优化；水果

随着人们生活水平的提高，公众对水果的消费需求日益增加。水果可以给人体提供糖类等必需营养物质，还可预防疾病、提高免疫力，有利于健康长寿[1-4]。糖类是水果的重要组成成分，研究表明，还原糖是水果中糖的主要类型，含量最高可占90%以上[5-7]。水果中的还原糖主要为葡萄糖和果糖，其种类及含量在果实营养价值和口感风味的形成过程中作出了重要贡献。Crespo等[8]认为，果糖比葡萄糖口感更甜，假设蔗糖的甜度参考值为100%，果糖和葡萄糖的相对甜度值则分别为170.3%和74%。这与许多研究者采用的总甜度指数=[(1.00×蔗糖) + (0.76×葡萄糖) +(1.50×果糖)] 理论[9]基本一致。Zhang等[10]发现，在2个甜瓜品种成熟过程中，果糖对其甜度形成的贡献最大。除影响水果品质外，还原糖在增强果实抗逆性、延长贮藏期等方面也发挥重要作用[11-13]。因此，建立准确快速测定水果中还原糖的实验室方法极为重要。

对于还原糖的测定方法，国家标准[14]采用滴定法，但此法操作繁琐，对滴定终点判断要求高，不利于实验室大量样品的测定。3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)是半微量定糖法，操作简便、快捷，杂质干扰较少，适合批量测定，是目前实验室测定还原糖最常用的方法[15]。苹果、桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝作为仁果类、核果类、浆果类、瓜果类、柑果类、热带水果的代表性果品种类，在我国乃至世界的产量均位列前茅[16]，研究并优化其还原糖测定方法具有显著的代表性。本文以还原糖含量为考察指标，利用 Design-Expert V8.0.6 软件中心组合设计，采用响应面分析法(Response surface method，RSM)优化DNS比色法测定苹果中还原糖含量的条件，以期获得最佳测定条件，从而为水果中还原糖的测定提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

U-3900型紫外-可见分光光度计(日本Hitachi高科公司)；HWS28型电热数显恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

葡萄糖(天津市科密欧化学试剂有限公司)；3,5-二硝基水杨酸(天津市光复精细化工研究所)；丙三醇、碳酸钙、亚铁氰化钾(天津市风船化学试剂科技有限公司)；乙酸锌(北京市旭东化工厂)；以上试剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水。

供试水果样品苹果、油桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝均购于本地超市。

1.2 标准溶液制备与样品还原糖的测定

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制作与标准溶液单因素试验 精确量取0.0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 mL浓度为1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液于6支10 mL具塞刻度试管中，分别以水调节体积至2 mL，各加入3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂并摇匀后，置于沸水中加热5 min。取出后放入冷水中冷却至室温，定容，于540 nm波长处比色。所得葡萄糖的标准曲线回归方程为y=149.3x+ 0.910 1(式中x表示吸光度，y表示葡萄糖浓度，mg/L)，吸光度与葡萄糖浓度之间呈良好的线性关系(r2=0.999 5)。

1.2.2 苹果样品中还原糖的测定 参照标准[17]方法进行。称取10 g苹果匀浆于烧杯中，加2 g CaCO3后用水转移至250 mL容量瓶中，置于80 ℃水浴保温30 min，取出后加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各3.3 mL以沉淀蛋白质等杂质，冷却至室温后用水定容，过滤。滤液按适当比例稀释并定容后，吸取1 mL样液进行测定。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 以还原糖含量为指标，分别考察DNS用量、显色时间、反应温度对苹果样品中还原糖浓度测定结果的影响。

1.3.2 RSM优化试验 在单因素试验的基础上，根据中心组合设计(Central composite design)，采用软件 Design Expert V8.0.6 建立3因素3水平的试验，通过拟合二次多项式方程，确定DNS法测定还原糖的最佳条件。以还原糖浓度(mg/L)为考察指标，DNS用量、显色时间和反应温度为自变量，因素水平编码见表1。

表1 试验自变量因素编码及水平

1.3.3 验证与方法考察 通过软件分析获得最佳测定条件后，按照优化条件进行提取测定，验证预测值的准确性。同时，按照优化的最佳测定条件，以不同材料验证该方法的精密度、重复性和准确度，并考察了该方法与传统滴定法测定结果之间的差异显著性及其时间稳定性。

1.4 统计分析

采用DPS 7.05数据处理软件的Duncan多重比较法(P<0.05)进行数据统计分析，EXCEL作图。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 试剂用量对还原糖含量的影响 吸取2.0 mL提取样液，分别以水作试剂空白，按照“1.2.1”方法考察了加入 不同DNS试剂用量(0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL)对还原糖含量测定的影响。结果显示，随着DNS用量的增加，测定的苹果还原糖浓度逐渐升高，当用量超过3.0 mL后，还原糖浓度增幅变缓，差异不显著。为了节省试剂，实验选择3.0 mL DNS为最佳试剂用量。

2.1.2 显色时间对还原糖含量的影响 吸取2.0 mL提取样液，以水做试剂空白，按照“1.2.1”方法分别考察1,3,5,7,10,15,20 min显色时间对苹果还原糖浓度的影响。结果表明，还原糖浓度随着显色时间的延长而逐渐升高，显色5 min时还原糖浓度最大，超过5 min后，还原糖浓度无显著变化。为保证反应稳定，选择5 min为最佳显色时间。

2.1.3 反应温度对还原糖含量的影响 吸取2.0 mL提取样液，以水作试剂空白，按照“1.2.1”方法分别考察了40,50,60,70,80,90,100 ℃反应温度对苹果还原糖浓度的影响。结果显示，在40～100 ℃范围内，随着温度的升高，还原糖浓度持续升高，当温度超过80 ℃后，还原糖浓度趋于稳定，差异不显著。为节约成本，选择80 ℃为最佳反应温度。

2.1.4 显色溶液稳定性试验 将苹果、油桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝的样品提取液按照“1.2.1”方法进行显色反应后，于540 nm波长下立即比色，扫描0～120 min时间范围内吸光度值的变化。结果显示，6种水果样液在显色30 min后，吸光度值下降速率为2.0%～5.2%；显色60 min后，下降速率为3.0%～9.9%；显色120 min后，下降速率为5.0%～20.4%。其中以葡萄的稳定性最好，油桃的稳定性最差。因此，显色溶液宜在30 min内测完，测定油桃样品时应尽量快速完成。

2.2 RSM实验设计方案与优化结果

2.2.1 设计方案与结果 在单因素试验的基础上，根据“1.3.2”设计方案，以RSM中心组合设计原理进行响应面试验。RSM是一种有效的统计分析方法，通过实验数据建立数学模型来实现受多因素影响的最优组合条件的筛选，其中，中心组合设计在食品工业中的应用较为广泛[18-20]。根据中心组合设计原理对3个主要影响因素进行了3因素3水平共20个实验点的响应分析试验，实验设计与结果如表2所示。结果显示，试验响应值与理论预测值基本相符。

表2 RSM实验设计与结果

(续表2)

NumberIndependentvariablecodevalueIndependentvariablenoncodingvalueResponsevalue(mg/L)X1X2X3DNSamount/mLReactiontime/minReactiontemperature/℃TrialvaluePredictedvalue500-16835631880037908611-14670846686267-1-1-1247077047797800035809287912290168036688089588856101114690951195981100035809003912212000358089439122131-1-144708212829214168004685809406917415-1112690807781771600035809152912217-11-1267078987869181-1144909137934519-168001325807585756320000358091829122

表3 回归模型的显著性检验结果

2.2.3 各因素对还原糖含量的影响分析 用各因素的F值可评价该因素对试验指标的影响，F值越大，表明该因素的影响越显著。由表3可知，F(X1)=103.52，F(X2)=2.97，F(X3)=52.18，即用DNS法测定还原糖含量时，各因素的影响顺序为DNS用量﹥反应温度﹥显色时间。

响应曲面的坡度变化及等高线形状可以反映因素对还原糖含量影响的强弱程度及其交互作用。响应曲面坡度陡峭时，表明响应值对处理条件的变化非常敏感；相应曲面相对平缓则说明其可容忍处理条件的影响。同时等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则表示两因素交互作用可忽略[22]。考察了DNS用量、反应温度、显色时间对测定还原糖含量影响的响应曲面和等高线图。结果显示，DNS用量和反应温度之间交互作用显著，随着用量增加和温度升高，还原糖浓度逐渐增大，在用量增至3 mL和温度升至80 ℃之后逐渐变缓(图1)。

2.2.4 最佳测定条件及验证实验 由Design-Expert V8.0.6软件分析得出最佳条件：DNS用量为3.94 mL，显色时间为5.23 min，反应温度为87.47 ℃，该条件下还原糖含量的理论浓度为96.03 mg/L。为检验该最佳测定条件的可靠性，进行了验证实验。考虑到实际操作的可行性，将测定条件改进为：DNS用量4.0 mL，显色时间5.0 min，反应温度87.0 ℃。通过3次平行实验，测得最佳条件下还原糖的浓度为94.66 mg/L，与理论值的相对误差仅为1.4%。因此，利用响应曲面法优化DNS比色法测定还原糖的最佳条件是可行的。

2.3 优化方法的精密度、重复性及准确度

利用响应曲面法优化后的条件对苹果、油桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝中还原糖含量进行测定，考察方法的精密度、重复性和准确度。分别吸取样液按照优化后方法连续测定9次，根据测定结果分别计算标准偏差(SD)和相对标准偏差；测得标准偏差为0.1%～0.5%，表明该方法精密度良好；相对标准偏差为2.0%～4.8%，均低于5.0%，表明该方法的重复性良好。

按照6种水果的还原糖含量，分别添加约0.5，1.0，2.0倍3个梯度(相当于样品还原糖含量)的葡萄糖后，计算其回收率，结果见表4。还原糖的回收率为90.6%～104.2%，表明该方法准确度良好。

表4 回收率测定结果

2.4 DNS法与滴定法测定结果的比较

采用国家标准方法[14]中的滴定法对苹果、油桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝中的还原糖含量进行测定，重复测定3次；同时从“2.3”的9次测定结果中随机选取3次，比较2种方法测定结果的差异显著性(表5)。由表5可以看出，除油桃外，采用2种方法测定的还原糖含量均无显著性差异。分析原因，可能是由于油桃中的还原糖含量偏低，采用滴定法测定时误差较大。滴定法测定还原糖时，对滴定液体积的要求较为严格，需控制在10 mL左右，否则误差较大[14]。本实验采用滴定法测定油桃中还原糖含量时滴定体积超过20 mL，测定结果应以DNS法为准。

表5 DNS法与滴定法测定6种水果中还原糖含量的比较

3 结 论

本文在单因素实验的基础上，采用中心组合设计及响应面分析，建立了DNS试剂用量、显色时间以及反应温度对水果中还原糖含量影响的回归模型，该回归模型R2=0.957 4，失拟项P=0.133 7﹥0.05，说明该模型与实际情况拟合良好。在试验设计范围内，影响DNS法测定还原糖含量的各因素，其影响顺序分别为：DNS用量﹥反应温度﹥显色时间。最佳条件为：DNS用量4.0 mL、显色时间5.0 min、反应温度87.0 ℃，按照优化的最佳条件，以苹果、桃、葡萄、哈密瓜、脐橙、菠萝6种水果验证该方法的精密度、重复性和准确度，其标准偏差为 0.1%～0.5%；相对标准偏差为2.0%～4.8%；回收率为90.6%～104.2%，方法的精密度、重复性和准确度良好。除油桃外，其他5种水果的测定结果与传统滴定法的测定结果无显著差异。该方法为水果中还原糖含量的测定提供了依据。

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Optimization of 3,5-Dinitrosalicylic Acid Colorimetry Determination Conditions of Reducing Sugar in Fruits by Response Surface Method

LI Zhi-xia，NIE Ji-yun*，YAN Zhen，LI Jing，KUANG Li-xue，SHEN You-ming

(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit(Xingcheng)，Ministry of Agriculture，Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xingcheng 125100，China)

The optimum reducing sugar determination conditions of 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry(DNS colorimetry) were investigated using the Response Surface Method(RSM).The reducing sugar content in apple was obtained under the optimum extraction conditions.Based on the results of the single factor experiments，an optimization procedure was carried out in order to investigate the effects of key parameters on reducing sugar determination.Optimization was conducted using a Central Composite Design(CCD) with three key factors of DNS amount，reaction temperature and coloration time.The quadratic term model of the determination conditions was established and the reliability was checked.The results of regression analysis presented a non-significant lack of fit(P=0.133 7) and a high coefficient of determination value(R2) of 0.957 4 for the response surface model,which showed a satisfactory agreement of the polynomial regression equation with experimental data.The influence of three factors followed the sequence as：DNS amount > reaction temperature > coloration time.The optimum determination conditions of reducing sugar using DNS colorimetry were DNS amount：4.0 mL，coloration time：5.0 min，reaction temperature：87.0 ℃.The actual concentration of reducing sugar was obtained to be 94.66 mg/L,which was consistent with the theory predicts under the optimal conditions.According to the optimum determination conditions，the precision，repeatability and accuracy of the method were verified using apple，peach，grape，hami melon，navel orange and pineapple as representative fruits.The standard deviations，relative standard deviations and recoveries of the reducing sugar contents in the 6 fruit species were in the range of 0.1%-0.5%，2.0%-4.8%，90.6%-104.2%，respectively.The study provided a reliable method for accurate，efficient and cost-effective detection of reducing sugar contents in fruits.

reducing sugar;response surface methodology(RSM);3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) colorimetry;optimization;fruit

2016-03-28；

2016-04-25

农业部农业行业标准制修订专项(2014301)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0032014013)；中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.011

O657.3;O629.1

A

1004-4957(2016)10-1283-06

*通讯作者：聂继云，博士，研究员，研究方向：果品质量与安全，Tel：0429-3598178，E-mail：niejiyun@caas.cn