用于糖链抗原CA19-9实时动态活检的免疫双光子荧光标记试剂盒

黄池宝, 张道海, 曾伯平, 刘其斌,陈华仕, 康 帅, 陈晓远

(1. 遵义师范学院化学化工学院, 遵义 563002; 2. 韶关大学农业科学与工程学院, 韶关 512005;3. 贵州大学材料与冶金学院, 贵阳 550025)



用于糖链抗原CA19-9实时动态活检的免疫双光子荧光标记试剂盒

黄池宝1,2, 张道海3, 曾伯平1, 刘其斌3,陈华仕1, 康 帅1, 陈晓远2

(1. 遵义师范学院化学化工学院, 遵义 563002; 2. 韶关大学农业科学与工程学院, 韶关 512005;3. 贵州大学材料与冶金学院, 贵阳 550025)

采用双光子荧光标记探针LP制备了免疫双光子荧光抗体LP-Ab, 以特异性识别肿瘤标志物CA19-9(Ag)形成抗原-抗体复合物(LP-Ab·Ag), 基于双光子诱导荧光机制用近红外激光(740 nm)激发LP-Ab·Ag, 利用LP-Ab·Ag的双光子荧光实现了CA19-9的高清晰度、 高灵敏度及高分辨率的量化检测和实时动态成像, 并制成用于糖链抗原CA19-9检测的简单便捷的双光子荧光标记试剂盒.

糖链抗原CA19-9; 抗CA19-9单克隆抗体(Ab19-9); 免疫荧光标记; 双光子; 活检

糖链抗原CA19-9(Carbohydrate antigen 19-9, Ag) 是一种与胰腺癌、 胆囊癌、 结肠癌和胃癌相关的肿瘤标识物[1～4]. 抗CA19-9单克隆抗体为1116 NS 19-9[5], 简称Ab19-9(Ab). CA19-9测定广泛用于结肠直肠癌、 胃癌、 胰癌、 肝细胞癌、 肺癌及乳癌的临床监测与诊断. 因此, 开展快速、 专一、 可靠地检测体内糖链抗原方法的研究, 对于早期肿瘤与癌症的诊治及预警具有重要的理论和现实意义.

目前有关CA19-9的检测方法[6～8]的专一性、 灵敏度及稳定性较差, 且操作繁琐, 检测试样限于血液与外周血. 直接免疫荧光法具有特异性强、 灵敏度高、 速度快和无放射性污染(与放射免疫法相比)等特点, 且其操作简便、 便于推广[9]. 单光子荧光激发波长通常为350～560 nm[10,11], 易产生光致毒与光漂白[12,13]; 而双光子荧光采用800～1100 nm的高强度激光作为激发光源, 不仅能克服单光子荧光的缺点, 还能实现深层暗场成像及定点激发, 避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸光系数, 从而显著提高成像的清晰度、 检测的灵敏度与分辨率[14～18].

芴衍生物具有较高的荧光量子产率和极佳的光稳定性[19,20], 且显示出优良的双光子吸收性能及较高的双光子吸收截面[21～25]. 特别是A-π-π-π-A(A为吸电子分支,π为含π键的共轭体系)型芴衍生物的荧光量子产率接近1, 双光子吸收截面高达约1185 GM[22,25]. Morales等[26]利用芴衍生物的双光子吸收优势, 引入二甘醇基团以提高化合物的水溶性, 开发出可用于生物标记的双光子荧光探针LP, 用其分别标记环肽C(RGDfK)和血清球蛋白G(IgG), 并用于COS-7细胞与HeLa细胞的成像研究.

本文选用LP标记抗CA19-9抗体Ab19-9, 制备了免疫双光子荧光抗体LP-Ab19-9, 利用抗原-抗体特异性识别原理和双光子诱导荧光机制, 实现了肿瘤标志物CA19-9的高清晰度、 高灵敏度及高分辨率的实时动态活检, 并制成用于CA19-9检测的简单便捷的双光子荧光标记试剂盒, 可方便快速地进行门诊化验与筛选. 拓宽了LP探针的应用范围, 也实现了肿瘤标志物CA19-9的实时动态检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

抗体Ab19-9(Ab, 上海江莱生物科技有限公司); PBS缓冲溶液(1.35 mol/L NaCl+47 mmol/L KCl+100 mmol/L Na2HPO4+20 mmol/L NaH2PO4, pH=7.4, 上海博谷生物科技有限公司); 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100, 化学纯, 广州市应泓化工有限公司); 培养基和胶原酶Ⅰ(北京索莱宝科技有限公司); 胎牛血清(FBS, 江苏雨桐生物科技有限公司); 牛血清白蛋白(BSA, 北京政博伟业生物科技有限公司); 乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA, 南京安培化工科技有限公司);N,N′-双(2-乙磺酸)哌嗪(PIPES, 南京安培化工科技有限公司);N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磷酸(HEPES, 南京安培化工科技有限公司); 所用试剂和溶剂均为分析纯, 试剂在使用前均经除水精制.

VARIAN INOVA 400 MHz核磁共振仪(美国Varian公司); HP 8453型紫外-可见分光光度仪(美国惠普公司); RF-5000型荧光分光光度仪(日本岛津公司); MD29 Spectra-max190型分光光度计(美国Molecular Devices公司); HP1100LC/ESI-MSD型电喷雾质谱仪(美国Agilent公司); FT/IR-430型红外光谱仪(波数扫描范围为350～7800 cm-1, KBr压片法, 日本Jasco公司); Perkin2400(Ⅱ)型元素分析仪(美国Perkin公司); Mira 900-F型锁模飞秒钛蓝宝石激光器(激光脉冲宽度120 fs, 重复频率76 MHz, 激光器的平均输出功率1.5 W, 可调波长范围为700～980 nm, 美国Coherent公司).

Fig.1 Molecular structure of LP

1.2 标记探针LP的合成

双光子荧光标记探针LP参照文献[26]方法合成, 黄色固体(结构见图1), m.p. 216～217 ℃, HRMS(EI)(C55H45N3O6S2计算值),m/z: 907.2806(907.2750).

2 结果与讨论

2.1 探针LP标记抗糖链抗原抗体

将2 mg(约10-5mmol)抗体Ab溶于0.5 mL二甲亚砜(DMSO)中, 用0.1 mol/L NaHCO3溶液将pH调至9, 将LP(10 μg, 1.1×10-5mmol)加入反应混合液中, 搅拌反应24 h. 反应结束后, 加入4倍混合液体积的乙醚稀释反应混合物, 析出沉淀, 过滤得固体, 再加入DMSO直至刚好溶解为止, 向溶解液中加入乙醚直至不再有沉淀析出, 过滤, 干燥, 得黄色固体(约1.8 mg), 即为标记抗体LP-Ab.

2.2 肿瘤单细胞悬液的制备

将FBS(100 g/L)、 青霉素(100 Units/mL)和链霉素(100 μg/mL)加入到细胞培养基DMEM中并混合均匀, 在此溶液中培养小鼠卵巢肿瘤细胞. 先将新鲜小鼠卵巢肿瘤组织剪碎成大小为1 mm3的碎块, 再加入胶原酶Ⅰ型(1 g/L)消化, 每30 min消化1次, 将消化下来的悬浮细胞用含血清的培养液中和胰酶, 离心并用培养液重悬细胞, 于4 ℃下保存, 待消化完全后, 将消化后的细胞悬液通过160～200目的筛网, 即得单细胞悬液. 将单细胞悬液接种到培养瓶中, 贴壁1.5 h后, 除去贴壁细胞(主要是成纤维细胞、 内皮细胞和巨噬细胞等), 得到较纯的备用肿瘤细胞. 成像前2 d进行细胞筛选处理. 采用同样方式制备小鼠胰腺肿瘤细胞.

成像操作前, 先除去培养介质再换成含Triton X-100(质量分数0.05%)的PHEMO缓冲液(68 mmol/L PIPES+25 mmol/L HEPES+15 mmol/L EGTA+3 mmol/L MgCl2+质量分数10%的DMSO).

2.3 标记抗体LP-Ab的吸收光谱与荧光光谱

标记抗体LP-Ab(吸收光谱和发射光谱的测定浓度分别为10和1 μmol/L)在含Triton X-100(质量分数0.05%)的PHEMO缓冲液中的最大吸收波长与发射波长分别为413 nm和485 nm(图略), 斯托克斯位移(Stokes shift)为72 nm, 吸收光谱与发射光谱在400～475 nm范围内有部分重叠, 但分隔得较清楚, 对荧光测试干扰较小. 采用双光子激发可以更大程度地消除这种激发光对发射光的影响. 经测定, LP-Ab的荧光量子产率为0.68, 具有较强的荧光, 可以提高检测的灵敏度与成像的清晰度.

2.4 标记抗体LP-Ab的双光子激发谱及双光子吸收截面

Fig.2 Two-photon action spectra of LP(a, 10 μmol/L) and LP-Ab(b, 10 μmol/L)

参照文献[27～30]方法测定了标记抗体LP-Ab(10 μmol/L)在含Triton X-100(质量分数0.05%)的PHEMO缓冲液中的双光子发射谱(如图2所示). 可见, 当双光子激发波长为740 nm时, LP-Ab的双光子吸收截面最大(960 GM), 且随双光子激发波长的增大而逐渐降低. 开始时双光子吸收截面随着波长增大降低速度较快, 之后降低速度显著变小. 因此, 选择740 nm作为双光子激发波长.

2.5 肿瘤细胞的实时动态活检

将肿瘤细胞用1 μmol/L LP-Ab在组织培养室中[CO2(体积分数5%), 37 ℃]孵化30 min, 用PBS缓冲液洗涤3次, 于无色血清游离介质中再孵化15 min后进行成像操作. 图3为用标记抗体LP-Ab标记的肿瘤细胞的双光子共聚焦荧光显微照片, 激发波长为740 nm, 收集450～500 nm通道的荧光.

Fig.3 TPM images of 1 μmol/L LP-Ab-labeled mouse pancreatic carcinoma cells collected at 450—500 nm(A) Magnification at 10×; (B) magnification at 40×. The images were collected upon excitation at 740 nm with a femtosecond pulse. Cells shown are representative images from replicate experiments(n=5).

2.6 免疫双光子荧光标记试剂盒

免疫双光子荧光标记试剂盒由双光子荧光标记抗体LP-Ab(10 μmol/L)、 硝酸纤维素膜、 封闭缓冲液[PBS(20 mmol/L, pH=7.4) + BSA(0.5 g/L)]和洗涤缓冲液 [含吐温20(质量分数0.05%)的 PBS溶液(50 mmol/L, pH=7.4)]组成. 双光子荧光标记试剂盒的操作步骤如下: 先用PBS稀释缓冲液(20 mmol/L, pH=7.4)将样品稀释至一定浓度, 并在硝酸纤维素膜上滴加2～6 μL 1 μmol/L标记抗体LP-Ab, 各点间相隔1～2 cm的距离, 于4 ℃下吸附0.5～1 h. 然后, 用多聚甲醛(质量分数4%)浸润硝酸纤维素膜15 min, 用PBS缓冲液浸洗硝酸纤维素膜(3 min×3). 将硝酸纤维素膜直接浸入封闭缓冲液内, 于37 ℃温育0.5～2 h. 用洗涤缓冲液清洗硝酸纤维素膜至少3次, 静置干燥后加入2～6 μL血清样品, 于37 ℃温育0.5～2 h; 再次用洗涤缓冲液清洗硝酸纤维素膜至少3次, 取出膜片用干净的吸水纸去除表面残余的液体. 最后, 将硝酸纤维素膜平铺在干净的玻璃片上, 在双光子荧光显微镜下观察检测结果, 如图4所示. 若观察到荧光, 则样品中含有抗原Ag, 说明存在肿瘤, 检测显阳性; 否则样品不含抗原, 样品正常, 检测显阴性, 如图5所示.

Fig.4 Negative(A) and positive(B) fluorescent images of 1 μmol/L LP-Ab-labeledmouse pancreatic carcinoma and normal cells under the eyepiece

Fig.5 Diagram of two-photon fluorescent labeling kit

综上， 本文用双光子荧光标记探针LP标记抗CA19-9抗体Ab19-9， 制备了免疫双光子荧光抗体LP-Ab19-9; 实现了肿瘤标志物CA19-9的高清晰度、 高灵敏度与高分辨率的实时动态活检; 将其制成用于CA19-9检测的双光子荧光标记试剂盒, 可方便快速地进行门诊化验与筛选.

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(Ed.: P, H, N, K)

Two-photon Fluorescent Labeling Kit for the Real-time Dynamic Biopsy of CA19-9†

HUANG Chibao1,2*, ZHANG Daohai3, ZENG Boping1, LIU Qibin3, CHEN Huashi1,KANG Shuai1, CHEN Xiaoyuan2

(1.ChemistryandChemicalEngineeringCollege,ZunyiNormalUniversity,Zunyi563002,China;2.CollegeofAgriculturalScienceandEngineering,ShaoguanUniversity,Shaoguan512005,China;3.CollegeofMaterialsandMetallurgy,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

Carbohydrate antigen CA19-9(Ag) is a tumor marker associated with pancreatic cancer, gallbladder cancer, colon cancer and gastric cancer in early stage of tumor and cancer stage. Antibody Ab19-9(Ab) to carbohydrate antigens were labeled to form probe-labeled antibody LP-Ab using the prepared two-photon fluorescence probe LP. On the basis of the antigen-antibody specificity affinity principle, LP-Ab could combine with carbohydrate antigen Ag into a complex LP-Ab·Ag, which was excited by near infrared laser(740 nm) and emitted strong two-photon fluorescence to accomplish the high sensitive biopsy and real-time dynamic high-resolution imaging of the tumor marker Ag with two-photon fluorescence microscope. Based on this, a simple and convenient two-photon fluorescent labeling kit was prepared to realize the rapid detection of tumor, which is convenient for large-scale clinic testing and screening. The research further broadens the application of LP, and provides a sharp tool for revealing the mechanism of cancer occurrence, development and metastasis. LP-Ab can be used to observe and study the dynamic transfer mechanisms of the tumor markers in cells and the mechanism of carcinogenesis.

Carbonhydrate antigen CA19-9; Antibody Ab19-9; Immunofluorescence labeling; Two-photon; Biopsy

10.7503/cjcu20150727

2015-09-17.

日期: 2016-03-10.

国家自然科学基金(批准号: 21562050, 11464052)、 贵州省第八批科技创新人才团队建设专项基金[批准号: 黔科合人才团队(2015)4007]、 贵州省科学技术基金项目(批准号: 黔科合J字[2015]2146, [2012]2345)、 贵州省教育厅自然科学重点研究项目(批准号: 黔教合KY字[2014]296, [2013]171)、 贵州省教育厅省级本科教学工程建设项目(批准号: 黔教[2014]JXGChcb)、 遵义市“15851人才精英工程”项目[批准号: (2015)4007]和遵义市红花岗区科学技术项目(批准号: 遵红科合社字[2015]18)资助.

O657

A

联系人简介: 黄池宝, 男, 博士, 教授, 主要从事双光子荧光探针研究. E-mail: huangchibao@163.com

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos. 21562050, 11464052), the Special Fund Project of the Construction of the Eighth Batch of Scientific and Technological Innovation Talent Team in Guizhou Province, China[No.(2015)4007], Guizhou Provincial Science and Technology Fund Project, China(Nos.J[2015]2146, J[2012]2345), the Key Project of Education Department of Guizhou Province(Nos.KY[2014]296), KY(2013)171), the Teaching Contents and Curriculum System Reform Project of Higher Education in Guizhou Province, China(No.KY [2014] JXGChcb), the Project of “15851 Talents Elite Project” in Zunyi City, China[No.(2015)4007] and the Science and Technology Project of Zunyi City Honghuagang District, China(No.[2015]18).