李世燕,闫公昕,牛广财,魏文毅,王鹤霖
(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319)
三氯化铝比色法测定毛酸浆果中总黄酮的研究
李世燕,闫公昕,牛广财,魏文毅,王鹤霖
(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319)
采用三氯化铝比色法对毛酸浆果中总黄酮的含量进行测定,建立一种测定毛酸浆果中总黄酮含量的方法。结果表明,以芦丁为标准品,通过全波段扫描确定标准品的最大吸收波长为370 nm。标准曲线的回归方程为y=15.814x+0.001 2,相关系数R2=0.999 2,在0~0.02 mg·mL-1范围内具有很好的线性关系。此测定方法的平均加标回收率为101.12%,稳定性、精密度以及回收率的相对标准偏差(RSD)分别为1.12%、1.32%、1.78%,方法检出限为0.4 mg·L-1。该方法可以用于毛酸浆果中总黄酮含量的测定。
三氯化铝比色法;毛酸浆;总黄酮
毛酸浆(Physalis pubescens L.)是茄科酸浆属一年生草本植物,别名黄菇娘、洋菇娘。其大多数分布在美洲热带及温带地区,少数分布在欧亚大陆及东南亚[1]。毛酸浆成熟后可以直接食用,果实皮薄汁多,果味清甜,营养丰富,除含有生物碱类、甾体类、脂类、黄酮类、有机酸类等[2],还含多种维生素、微量元素和人体需要的氨基酸[3-4]。毛酸浆具有解除疲劳、消除肌肉疼痛、降低血压、预防动脉硬化和心血管疾病的发生和保护皮肤等作用[5]。因此,毛酸浆属于纯天然、高营养的绿色食品,被作为一种很有开发价值的资源备受食品研究人员的关注[6]。
黄酮类化合物具有多种生理活性,如抗氧化作用、抗微生物、螯合金属离子、保护DNA、抑制肿瘤等作用[7]。因此,食物类黄酮物质的生物学作用及其机制的研究已成为当今营养与食品科学研究领域内热点之一[8]。目前,比色法测定总黄酮的方法以其操作简单、结果准确可靠等优点,广泛应用于生产中的质量控制,并已被我国药典收录[9]。但是,不同植物黄酮类组成不同,其适宜的测定方法也有所区别。目前还未见有关毛酸浆果中总黄酮含量测定方法的研究,所以,建立一种具有指导意义的毛酸浆中总黄酮测定方法是必要的,采用三氯化铝比色法对毛酸浆果中总黄酮的含量进行测定,以期建立了一种测定毛酸浆果中总黄酮含量的方法。
1.1 材料与试剂
芦丁标准品,sigma公司出品;毛酸浆,购于黑龙江省大庆市农贸市场;三氯化铝,分析纯,天津市河东区红岩试剂厂;醋酸钠,分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;冰醋酸,分析纯,天津市光复科技发展有限公司;亚硝酸钠,分析纯,天津市河东区红岩试剂厂;九水合硝酸铝,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠,分析纯,天津市大茂化学试剂厂;甲醇,分析纯,天津市大茂化学试剂厂;实验用水为去离子水。
1.2 仪器与设备
UV-1100型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器;Exploter分析天平,奥豪斯仪器上海有限公司制造;Seven-Multi型pH综合测试仪,梅特勒-托利多(上海)制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 芦丁标准品溶液的制备
精确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品10 mg置于100 mL的容量瓶中,加适量甲醇溶解后,用甲醇定容至刻度线,充分摇匀,配成0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液,备用。
1.3.2 样品处理
取100.00 g毛酸浆果破碎榨汁,将破碎后的毛酸浆原浆离心(4 000 r·min-1,15 min),得到澄清的毛酸浆果汁样品,备用。
1.3.3 最大吸收波长的选择
准确量取芦丁对照品标准溶液和毛酸浆果样品溶液各1 mL置于25 mL容量瓶中,加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL,混匀,然后加入pH=5.5的HAc-NaAc缓冲液5 mL,用水定容至刻度线,混匀,放置20 min[10]显色,同时制备空白液。在紫外分光光度计上300~500 nm进行全波长扫描,确定反应体系的最大吸收波长。
1.3.4 显色条件的影响
(1)AlCl3加入量的影响。精密量取5份1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL容量瓶中,分别加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液2,4,6,8,10 mL,然后加入pH=5.4的HAc-NaAc缓冲液5 mL,用水定容至刻度线,混匀,放置20 min。以AlCl3溶液加入量为横坐标,吸光度值A为纵坐标绘图,研究AlCl3溶液加入量对显色反应的影响。
(2)pH值的影响。精密量取5份1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL容量瓶中,加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL,然后分别加入pH值分别为4.8,5.0,5.2,5.4,5.6的NaAc-HAc缓冲液5 mL,显色20 min。以pH值为横坐标,吸光度值A为纵坐标绘图,研究pH值对显色反应的影响。
(3)显色时间的影响。精密量取5份1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL容量瓶中,加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL,然后加入pH=5.4的NaAc-HAc缓冲液5 mL,分别显色5,10,15,20,25 min。以显色时间为横坐标,吸光度值A为纵坐标绘图,研究显色时间对显色反应的影响。
1.3.5 标准曲线的绘制及其回归方程的建立
精密移取芦丁标准液0,1,2,3,4,5 mL分别置于25 mL容量瓶,按1.3.4项最优方法显色,以不加芦丁标准液的溶液为空白参比。用紫外-可见分光光度计在370 nm处测定吸光度值,每个浓度平行测定3次,取平均值。以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.6 稳定性试验
准确吸取1 mL毛酸浆果汁样品溶液置于25 mL容量瓶中,按1.3.4项下方法显色,按0,10,20,30,40,50,60 min时间间隔放置后分别在370 nm下测其吸光度值,同时计算RSD值,考察该方法的稳定性。
1.3.7 精密度试验
准确吸取5份1 mL的毛酸浆果汁样品溶液置于25 mL的容量瓶中,按1.3.4项下方法显色红后分别在370 nm下测其吸光度值,同时计算RSD值。
1.3.8 加样回收率试验
准确吸取6份1 mL的毛酸浆果汁样品溶液置于25 mL容量瓶中,每2份1组,共3组,分别加入芦丁对照品标准溶液1,2,3 mL,按照1.3.4项下方法显色后分别在370 nm下测其吸光度,同时计算回收率。
1.3.9 检出限试验
准确吸取12份试剂空白溶液置于25 mL的容量瓶中,分别在370 nm下测其吸光度值,计算LOD值,考察三氯化铝比色法测定毛酸浆样品溶液中总黄酮的方法检出限。
2.1 最大吸收波长的确定
由图1可知,芦丁对照品标准溶液和毛酸浆果样品溶液显色后均在波长370 nm处有最大吸收峰值,故选择370 nm作为检测波长。
图1 芦丁标准品溶液(b)和毛酸浆果样品溶液(a)的紫外可见光谱图Fig.1Scanning spectra of standard rutin solution(b)and Physalis Pubescens L.fruit(a)
2.2 显色条件的影响结果分析
2.2.1 AlCl3加入量的影响
由图2可以看出,0.1 mol·L-1的AlCl3溶液加入量在4 mL时,吸光度值最大,说明在370 nm测定波长条件下,AlCl3溶液加入量为4 mL时,AlCl3与毛酸浆样品溶液中的总黄酮完全络合且吸光度稳定。随着加入量的增大,吸光度减小,说明显色不稳定。因此认为0.1 mol·L-1的AlCl3溶液加入量为4 mL时最佳。
图2 AlCl3溶液加入量对显色反应的影响Fig.2The effect of AlCl3adding amount on color reaction
2.2.2 pH值的影响
由图3可以看出,随着NaAc-HAc缓冲液pH值的提高,吸光度值逐渐增大,在pH=5.4时吸光度值最大,说明在该pH值下该体系反应完全且生成的络合物稳定。继续增大pH值,吸光度值减小,因为酸性较强时会破坏AlCl3与总黄酮反应生成的络合物的结构[11]。因此选择pH值为5.4的NaAc-HAc缓冲溶液作为显色条件之一。
图3 pH值对显色反应的影响Fig.3 The effect of pH on color reaction
2.2.3 显色时间的影响
由图4可知,随着显色时间的延长,吸光度值逐渐增加,20 min后随着显色时间的延长,吸光度值不再变化,说明20 min时显色完全且在370 nm波长测定条件下显色比较稳定。因此三氯化铝比色法测定毛酸浆样品溶液总黄酮含量时,显色20 min即可。
图4 显色时间对显色反应的影响Fig.4The effect of reaction time on color reaction
2.3 芦丁标准曲线与线性回归方程
根据芦丁在氯化铝显色体系中浓度与吸光度值关系图可知,芦丁标准溶液在0.00~0.02 mg·mL-1范围内与吸光度值间有良好的线性关系,在此范围内的线性回归方程为y=15.814x+0.001 2,相关系数R2=0.999 2。
2.4 稳定性试验结果
稳定性考察结果见表1。由表1可知,毛酸浆果样品溶液在60 min内的RSD值为1.12%,表明该方法下的毛酸浆果样品溶液在60 min内显色较稳定。因此,样品混合均匀后,为了使显色稳定,放置时间不能超过60 min。
表1 稳定性试验结果Table 1The results of stability test
2.5 精密度试验结果
精密度考察结果见表2。由表2可知,毛酸浆果样品溶液吸光度值的RSD=1.32%。说明该方法测定毛酸浆总黄酮含量的精密度结果在误差范围内,测定的数据准确可信,精密度良好。
表2 精密度试验结果Table 2The results of precision test
2.6 加标回收率试验
加样回收率试验结果见表3。结果表明,6次测定的平均加样回收率为101.12%,RSD=1.78%。说明该测定方法得到的回收率良好。
表3 加样回收率试验结果Table 3The results of recovery test
2.7 检出限试验
检出限试验结果见表4。由表4可知,三氯化铝比色法测定毛酸浆果中总黄酮含量的方法检出限为0.4 mg·L-1。说明该方法测定毛酸浆果中总黄酮含量的灵敏度较高。
表4 检出限试验结果Table 4The results of detection limit test
三氯化铝比色法测定毛酸浆果中总黄酮时,样品的最大吸收波长为370 nm。标准曲线的回归方程为y=15.814 x+0.001 2,R2=0.999 2,稳定性、精密度、回收率的RSD分别为1.12%、1.32%、1.78%,方法的检出限为0.4 mg·L-1,该测定方法简便、快捷、操作简单,可以用于毛酸浆果中总黄酮含量的测定。该方法测得的总黄酮含量为0.442 mg·g-1。
[1]许亮,王荣祥,杨燕云,等.中国酸浆属植物药用资源研究[J].中国野生植物资源,2009,28(1):21-23.
[2]张娜,别智敏,秦文静,等.酸浆的化学成分及生理功效[J].吉林医药学院学报,2008,29(2):104-107.
[3]贾远敏,陈重,许琼明,等.毛酸浆浆果的化学成分研究[J].中草药,2013,44(9):1086-1090.
[4]刘志明,赵思祥,张瑞.毛酸浆山楂复合果汁饮料的研制[J].饮料工业,2008,11(8):71-72.
[5]李栋,李少鹏,田美荣,等.毛酸浆酶解工艺条件的优化[J].食品工业,2013,34(11):141-143.
[6]王文利.毛酸浆果醋的工艺研究[D].长春:吉林农业大学,2012.
[7]金红,段辉,何亚敦,等.保健酒中总黄酮测定方法的比选[J].酿酒科技,2009(2):79-81.
[8]杨宏志,王瑞峰.大孔树脂分离沙棘叶总黄酮工艺的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2014,26(6):58-60.
[9]赵恩泽,金时,魏作富,等.木豆叶总黄酮测定方法的比较研究[J].植物研究,2011,31(4):499-502.
[10]刘金贤,王磊,管仁伟,等.比色法测定黄芩总黄酮的显色条件研究[J].中医药学报,2012,40(6):34-36.
[11]马陶陶,张群林,李俊,等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J].时针国医国药,2008,19(1):54-56.
Determination of Total Flavonoids in Physalis Pubescens L.by Aluminium Trichloride Colorimetric method
Li Shiyan,Yan Gongxin,Niu Guangcai,Wei Wenyi,Wang Helin
(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319)
To establish a method for the determination of total flavonoids in Physalis Pubescens L.,aluminium trichloride Colorimetric method was applied.The experimental results showed that the maximum absorption wave 370 nm was observed with the reference material of rutin.The correlation equation was y=15.814x+0.001 2,the correlation coefficient was 0.999 2,it showed a very good linear relationship within the range of 0.00 mg·mL-1to 0.02 mg·mL-1.The stability,precision and average recovery rate of this method was 1.12%,1.32%and 1.78%by RSD,respectively,and the average recovery rate was 101.12%and the detection limit was 0.4 mg·L-1.This method could be used to determine the total flavonoids in physalis pubescens L..
aluminium trichloride colorimetric method;physalis pubescens L.;total flavonoids
O657.32
A
1002-2090(2016)04-0045-04
10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.011
2015-05-10
黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2015-Y49)。
李世燕(1989-),女,黑龙江八一农垦大学食品学院2014级硕士研究生。
牛广财,男,教授,E-mail:gcniu@126.com。