家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

刘慧敏，常洪涛，贺秀媛，陈 陆，杨 霞，王新卫，李永涛，赵 军，王川庆



家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

刘慧敏1，常洪涛2，贺秀媛2，陈 陆2，杨 霞2，王新卫2，李永涛2，赵 军2，王川庆2

目的 以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原，建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体。方法 应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒，并在感受态细胞BL21中表达，将该重组蛋白纯化后作为包被抗原，建立间接ELISA标准化检测程序，并应用于临床检测。结果 经双酶切、PCR和测序鉴定，重组质粒pET-28a-VP1构建成功，转化后诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白，该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别，具有良好的反应原性；通过优化反应条件，确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度，5%脱脂乳作为封闭液，待检血清的最佳作用时间为37 ℃作用60 min，酶标抗体稀释度的最佳工作浓度和最佳作用时间分别为1∶8 000和37 ℃ 30 min，底物最佳显色时间为20 min，特异性强，敏感性较高，重复性良好；应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清，发现阳性场检出率为65.87%，血清总阳性率为45.30%，不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染，中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场，EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14%。结论 应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平，临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白。

脑心肌炎病毒；VP1蛋白；原核表达；间接ELISA；临床检测

脑心肌炎(Encephalomyocarditis，EMC)是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和繁殖障碍为主要临诊特征的人畜共患传染病[1]。EMCV为单股正链RNA病毒[2]，全长约7.8 kb，结构蛋白VP1处于病毒粒子最表面，是最重要的中和性抗原表位所在区域，受选择性压力的影响，需要不断发生变异以维持病毒存活，并与病毒粒子表面的拓扑结构、受体吸附及脱壳有关[3]。尽管当前国内并未发生严重疫情，但已证实多个省市猪场中存在感染，只是抗体阳性率差异较大[4-7]。随着近年来国际交往日益频繁，加之国内地理环境复杂，生物多样性丰富，从而为EMCV的发生、传播和流行提供了有利条件，受其威胁的危险性日趋严重。及时了解本地猪群中EMCV的感染状况，对于有效防制该病和保障人类健康具有重大意义，而建立一种快速、准确、特异和敏感的抗体检测方法尤为关键。本试验旨在对所分离的家养野猪源EMCV JZ1202株的VP1基因进行原核表达和鉴定，并以该重组蛋白作为包被抗原，建立可用于检测血清中EMCV抗体的间接ELISA方法，为该病的诊断、免疫检测和流行病学调查提供技术手段，也为ELISA 抗体诊断试剂盒的研制奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、感受态细胞和表达质粒 家养野猪源EMCV JZ1202株、大肠杆菌DH5α、感受态细胞BL21和原核表达载体pET-28a均由本实验室提供。

1.2 血清 猪抗EMCV阳性血清、EMCV阴性血清以及猪其他重要病毒性疾病如猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪伪狂犬病(PR)、猪细小病毒病(PPI)和猪圆环病毒病(PCVD)的阳性血清均由本实验室制备。1 618份待检血清由2013年11月至2015年3月间河南省126个猪场送检。另有未免疫PCV-2疫苗的猪场送检的527份血清，经检测为PCV-2抗体阳性。

1.3 主要试剂 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)、Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)、羊抗鼠酶标二抗(HRP标记)和DAB显色试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品；蛋白分子量标准(14.4～97.4 kDa)和PVDF膜均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他常规试剂和分子生物学试剂均由本实验室提供。

1.4 VP1基因的原核表达

1.4.1 pET-28a-VP1原核表达载体构建

1.4.1.1 引物设计 利用Primer Premier 5.0软件，参考EMCV BJC3 株全基因序列(GenBank登录号：DQ464062)，设计可覆盖完整VP1基因的一对特异性引物，并在上、下游引物分别引入BamH I和EcoR I酶切位点，预期扩增片段为831 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成：

EMCV-VP1-F：5′-GAC GGA TCC GGG GTA GAA AAC GCT GAA AG-3′

EMCV-VP1-R：5′-GCC GAA TTC CTC TAG CAT CAA GAC TCC AG-3′

1.4.1.2 目的基因扩增 取JZ1202株的细胞培养液，应用Trizol LS Reagent提取总RNA，反转录成相应片段的cDNA后进行RT-PCR，反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min，共 35 个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取10 μL PCR产物进行电泳、回收和纯化。

1.4.1.3 重组表达质粒制备 将纯化的VP1目的片段与原核表达载体pET-28a进行BamH I、EcoR I双酶切、胶回收和连接。随后转化DH5a感受态细胞，37 ℃过夜培养，筛选阳性菌落增菌培养，提取质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。将鉴定正确的重组质粒送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序，确定是否存在碱基的缺失、插入或突变，读码框是否移码等，将鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET-28a-VP1。

1.4.2 重组质粒诱导表达 将pET-28a-VP1转化感受态细胞BL21，均匀涂布于LB平板(Amp+)，培养12 h，挑取阳性重组菌的白色单菌落，再接种于LB液体培养基(Amp+)中，37 ℃ 200 rpm/min振荡培养过夜，按1∶100比例接种LB液体培养基(Amp+)，37 ℃振荡培养2 h，至对数生长中期(OD600nm=0.5～1.0)，加入IPTG至终浓度1 mmol/L进行诱导，分别取样0、4、6 h时的样品1 mL，参照《分子克隆实验指南》第三版中SDS-PAGE试验方法[8]，稍加修改进行检测。

1.4.3 重组蛋白的纯化 将IPTG诱导6 h的菌体置于冰浴条件下超声裂解，至菌体较清亮为止，4 ℃ 12 000 rpm/min离心25 min，取沉淀进行SDS-PAGE分析。同时将该沉淀按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，并进行SDS-PAGE分析。

1.4.4 重组蛋白的Western blotting检测 将纯化蛋白作SDS-PAGE，采用湿转法将其转移至PVDF膜，200 mA恒流，1.5 h～2 h；用含5%脱脂奶粉的TBS封闭转印后的PVDF膜，室温1～2 h；倒掉封闭液，加入PBS清洗PVDF膜3～5次，每次10 min；加入1∶2 000稀释的EMCV阳性血清(一抗)37 ℃震荡孵育1～2 h；弃一抗，TBST冲洗PVDF膜3～5次，每次10 min；加入1∶4 000稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，37 ℃震荡孵育1～2 h后，将PVDF膜取出用TBST充分清洗3～5次至洁净；避光滴加DAB显色液于PVDF膜，至出现清晰的特异性条带，拍照。

1.5 间接ELISA方法最佳反应条件优化 应用矩阵法将倍比稀释的VP1重组蛋白包被后，加入不同稀释度的待检血清进行ELISA，筛选P/N值最大的抗原浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度；分别选择0.1% BSA、5%脱脂乳和1%明胶进行封闭，以筛选最佳封闭液；酶标板包被抗原、封闭处理后，分别置于室温和37 ℃下反应30 min、45 min和60 min，进行ELISA以确定待检血清最佳作用时间；将酶标抗体分别作1∶5 000、1∶8 000和1∶10 000稀释，进行ELISA以确定最佳工作浓度，再分别置于室温和37 ℃下反应30 min、45 min和60 min，进行ELISA以确定最佳作用时间；酶标抗体作用完成后，加入TMB显色液，37 ℃避光条件下分别显色10 min、20 min和30 min，进行ELISA以确定底物最佳显色时间；将20份经中和试验判定为EMCV抗体阴性的血清，按上述已优化的ELISA反应条件进行检测，计算出OD450值，经统计学分析获得平均值(X)和标准方差(SD)。根据生物统计学原理，OD450值≥(X+3SD)时判为阳性，OD450值≤(X+2SD)判为阴性，介于两者间判为可疑。分别取CSF、PRRS、PR、PPI和PCVD的阳性血清进行间接ELISA，观察是否存在交叉反应，以判定其特异性，同时设立EMCV标准阴性、阳性血清对照；选取15份猪血清，分别应用中和试验和间接ELISA进行检测，比较二者的最高检出稀释度和符合率，以评估其相对敏感性；分别使用同1批次和3个不同批次表达纯化的VP1重组蛋白进行包被，应用间接ELISA对4份血清样品和1份阴性血清进行3次批内重复试验和3次批间重复试验，计算变异系数，以评价其稳定性和准确性。

1.6 EMC血清流行病学调查 应用所建立的EMCV抗体间接ELISA方法，分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清。

2 结 果

2.1 获得原核表达抗原

2.1.1 VP1基因RT-PCR及构建的重组表达质粒鉴定 应用RT-PCR扩增得到长为831 bp的目的片段，与预期相一致(图1)。对重组原核表达质粒pET-28a-VP1进行PCR鉴定时可获得831 bp的扩增条带(图2)。BanH I和EcoR I双酶切时可切出约5 900 bp和831 bp的2个基因片段(图3)，与预期结果相符。测序结果表明插入的VP1 基因片段长度和序列准确。

M：DL2000 DNA Marker；1：Positive control；2-3：VP1 gene；4：Negative control图1 VP1基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplication of VP1 gene

M：DL2000；1：Positive control；2-6：VP1 gene；7：Negative control图2 重组表达质粒的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid

2.1.2 诱导表达和SDS-PAGE 各诱导表达产物经SDS-PAGE分析，大小与预期结果相符，表达量较大(图4)。而且融合蛋白的表达量随诱导时间延长而增加，于诱导后6 h达到高峰。进一步分析显示，该重组蛋白以不溶性包涵体存在。

1：DL15000 DNA Marker；2：recombinant plasmid；3：Empty plasmid；4：recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion；5：VP1 gene；6：DL1000 DNA Marker

图3 重组表达质粒的双酶切鉴定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion

1-3: pET28a-VP1 induced with IPTG for 0, 4, 6 h；4: Protein molecular weight marker (kDa)

图4 不同时间诱导表达VP1蛋白的SDS-PAGE鉴定

Fig.4 SDS-PAGE identification of expressed under induction with IPTG at different time

2.1.3 VP1重组蛋白得到纯化 重组VPl蛋白纯化后经SDS-PAGE分析，得到高纯度的目的蛋白(图5)，测定浓度为5.0 mg/mL。

2.1.4 重组蛋白经Western Blotting证明为VPl抗原特异性 将纯化的重组蛋白湿法转印至PVDF膜上，在约30.5 kDa处出现一条特异性反应条带(图6)。表明VP1基因在大肠杆菌中被诱导表达后，获得的重组蛋白能被EMCV阳性血清所识别，发生特异性的免疫印迹反应，说明具有良好的抗原反应原性。

1: Unpurified soluble protein；M:Protein molecular weight Marker 2: Unpurified inclusion body protein；1-4: Collected liquid of inclusion body protein after column M: Protein molecular weight Marker；5: Elution collected liquid of inclusion body protein 图5 重组VP1蛋白纯化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant VP1 protein

M: Protein molecular weight marker；1-2: Purified VP1 protein图6 重组VP1蛋白Western Blotting检测Fig.6 Identification of recomibant VP1 protein by WB

2.2 间接ELISA反应条件 当抗原浓度为1.25 ug/mL，待检血清以1∶80倍稀释时，P/N值最大，可确定为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度；以5%脱脂乳作为封闭液时，P/N值最大，可选其作为封闭液；当待检血清在37 ℃作用60 min时，P/N值最大，可确定为最佳作用时间；当酶标抗体稀释度为1∶8 000，作用时间为37 ℃ 30 min时，P/N值最大，可确定为最佳工作浓度和最佳作用时间；底物显色20 min时，P/N值最大，可确定为最佳显色时间；20份阴性血清中，OD450值最大为0.325，最小为0.094，平均值为0.208，标准方差为0.071 2，计算临界值为：阳性为0.208+3×0.071 2=0.42，阴性为0.208+2×0.071 2=0.35，介于两者之间判为可疑。5种猪病毒性疾病的阳性血清反应后，OD450值均小于0.42，表明所建立的间接ELISA方法特异性良好，无交叉反应；15份猪血清经中和试验检测出阳性4份，经ELISA方法检测出阳性5份，二者符合率为93%，表明所建立的间接ELISA方法敏感性较高；经计算，批内重复试验的变异系数为7.35%，批间重复试验的变异系数为7.18%，表明所建立的间接ELISA方法重复性良好。2.3 EMC血清流行病学 对河南省126个猪场送检的1 618份血清进行EMCV抗体检测(表1)，其中阳性检出场为83个(65.87%)，阳性血清数为733份(45.30%)。种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的血清总阳性率分别为38.94%、50.43%、53.57%和56.27%。规模化猪场总阳性率为41.87%，种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的阳性率分别为35.91%、46.38%、47.13%和52.08%；中小型猪场总阳性率为50.89%，种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的阳性率分别为43.62%、56.25%、60.49%和66.36%。调查结果显示，河南省不同规模、不同阶段猪群中均存在着严重的EMCV感染。527份PCV-2抗体阳性猪血清中，EMCV抗体检测阳性率高达75.14%，提示二者混合感染极为普遍(表2)。

表1 不同规模猪群中EMCV抗体检测
Tab.1 EMCV antibody detections in pig farms of different sizes

猪场Pigfarms母猪Sows公猪Boars后备猪ReserveSwine商品猪Commercialpigs合计Total规模化猪场Large-scalepigfarms血清数Serumnumber58269872651003阳性数Positivenumber2093241138420阳性率(%)Positiverate35.9146.3847.1352.0841.87中小型猪场Smallandmediumsizepigfarms血清数Serumnumber3764881110615阳性数Positivenumber164274973313阳性率(%)Positiverate43.6256.2560.4966.3650.89合计Total血清数Serumnumber9581171683751618阳性数Positivenumber3735990211733阳性率(%)Positiverate38.9450.4353.5756.2745.30

表2 PCV-2抗体阳性血清中EMCV抗体的检测
Tab.2 EMCV antibody detection of the PCV-2 antibody positive serum

血清数Serumnumber阳性数Positivenumber阳性率(%)Positiverate(%)52739675.14

3 讨 论

在EMCV结构蛋白中以VP1抗原性最强，多作为靶目标来制备诊断抗原和设计新型疫苗。大肠杆菌遗传背景清晰，生长速度迅速，可根据试验要求对其进行突变改造，并可稳定、高效的复制或表达转入的外源基因，近年来已在多种动物病原研究中得到广泛应用[9-11]，但针对家养野猪源病原体的原核表达研究的报道尚不多见。本试验首次应用原核表达载体pET-28a成功构建了家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒pET-28a-VP1，并在感受态细胞BL21中得到高效表达。经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定，所表达的重组蛋白大小约为30.5 kDa，有良好的抗原反应原性，在IPTG 诱导6 h时，表达量最大，并主要以包涵体的形式存在，这与盖新娜的研究相一致[7]，这可能与VP1蛋白的氨基酸组成或表达速度过快，易富集于胞浆等有关。

动物感染EMCV后可产生抗体，但病毒会随着抗体的出现而逐步减少，尤其在感染中后期或康复期，在体内几乎检测不到病毒，因此抗体检测更具价值，不仅是流行病学调查的主要技术手段，也可用来辅助临床诊断。血清中和试验被广泛应用于EMCV的免疫学检测，特异性较高，但操作繁琐。血凝抑制试验和琼脂扩散试验等在EMCV早期研究中发挥了重要作用，但均不利于大批量检测和快速诊断。ELISA方法快速、灵敏、操作相对简单和易标准化，从而适合用于EMCV实验室诊断和大规模普查，但目前尚无成熟的市售试剂盒。本试验以原核表达成功的VP1重组蛋白作为包被抗原，通过优化反应条件，建立了间接ELISA标准化检测程序，特异性强，敏感性较高，重复性良好，可用于EMCV的流行病学调查和早期诊断。

近年来，随着对EMC公共卫生问题的日趋重视，国内多个实验室开展了血清流行病学调查，并证实大部分省市猪群中普遍存在感染，但抗体阳性率差异较大。盖新娜等(2005)首次证实我国13个地区规模化养猪场的平均阳性率为75.84%，随后刘亚兰等(2009)检测河北省31个规模化猪场、陆文俊等(2011)检测广西地区猪场、樊得英等(2012)检测甘肃省规模化猪场的抗体阳性率分别为13.48%、91.47%和62.8%。应用本试验所建立的间接ELISA方法，对河南省126个猪场送检的1 618份猪血清进行检测，阳性场检出率65.87%，血清总阳性率为45.30%，种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的血清总阳性率分别为38.94%、50.43%、53.57%和56.27%，表明该省猪群中EMCV感染极为普遍。不同规模、不同阶段猪群中均存在着严重的EMCV感染，中小型猪场的阳性率明显高于规模化猪场，这应与其养殖环境恶化、鼠害泛滥、饲养者养殖理念落后以及引种混乱等有关。

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s:Chang Hong-tao,Email:ndcht@163.com;Wang Chuan-qing,Email:wchuanq@163.com

Development and application of indirect ELISA for detection of antibodies against encephalomyocarditis virus based on prokaryotic expression of VP1 protein

LIU Hui-min1, CHANG Hong-tao2, HE Xiu-yuan2, CHEN Lu2, YANG Xia2,WANG Xin-wei2, LI Yong-tao2, ZHAO Jun2, WANG Chuan-qing2*

(1.CollegeofLifeScience,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou, 450002,China;2.CollegeofAnimalMedicineandHusbandry,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002,China)

We developed an indirect-ELISA method to detect the antibodies against encephomyocarditis virus (EMCV) using the prokaryotic expression of viral protein 1 as antigen. VP1 gene of EMCV was amplified and cloned into the prokaryotic expression vector pet-28a to obtain the recombinant expressed plasmid, and then were transformed into competent cells BL21 for expression. The recombinant protein purified was used as antigen to develop the indirect-ELISA standard detection procedure for clinical application. Results showed that the recombinant expression plasmid pet-28a-VP1 was identified by double digestion, PCR and sequence analysis. They were transformed into competent cells for expression, and VP1 protein was highly expressed by SDS-PAGE analysis. The recombinant protein was recognized specifically by positive serum of EMCV, the optimal antigen concentration was 1.25 ug/mL, the optimal reaction condition of serum samples was 60min at 37℃, the optimal dilution concentration and time of antibodies labeled with enzyme was 1∶8 000 and 30 min at 37 ℃ respectively, and the optimal color time of substrate was 20 min. The indirect-ELISA method was with high specificity and sensitivity, and good repeatability. The survey results showed that the detection rate of positive farm was 65.87% , and total serum positive rate was 45.3% in Henan Province. EMCV infection existed in different size and stages pig farms, compared with large-scale ones, small and medium-sized had higher positive rate, moreover, mixed infection rates with PCV-2 as high as 75.14%. In conclusion, the developed indirect ELISA method based on recombinant VP1 protein as coating antigen is useful for the detection of the EMCV antibody in clinical samples，which filled the surveillance gap of serum epidemiological of EMCV in Henan Province.

encephalomyocarditis virus; VP1 protein; prokaryotic expression; indirect ELISA; clinical detection

河南省高校科技创新团队支持计划(No.14IRTSTHN015)和国家自然科学基金委(No.31272567)资助

常洪涛，Email：ndcht@163.com

王川庆，Email：wchuanq@163.com

1．河南农业大学生命科学学院，郑州 450002；

2．河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.009

R373

A

1002-2694(2016)08-0728-06

2015-08-16；

2016-01-18

Henan Province University Science and Technology Innovation Team Support program (No.14IRTSTHN015) and National Natural Science Foundation of China (No.31272567)