淡水发光菌青海弧菌Q-67对环境激素类物质毒性检测应用研究进展

张 超， 王 莎， 邓小云

(1.西藏自治区环境保护厅环境工程评估中心，西藏 拉萨 850000；2.成都粮油股份有限公司，四川 成都 611400；3. 四川省射洪县畜牧食品局，四川 射洪 629200)



淡水发光菌青海弧菌Q-67对环境激素类物质毒性检测应用研究进展

张 超1， 王 莎2， 邓小云3

(1.西藏自治区环境保护厅环境工程评估中心，西藏 拉萨 850000；2.成都粮油股份有限公司，四川 成都 611400；3. 四川省射洪县畜牧食品局，四川 射洪 629200)

摘要：以新型淡水发光菌——青海弧菌 Q67(Vibrio—qinghaiensis s p.-Q67) 为检测生物，以Veritas TM微孔板光度计为发光强度测试设备，建立了测定环境污染物对发光菌发光强度抑制毒性的微板发光测试新方法。指出了随着对淡水发光细菌Q-67研究的不断进行，该菌种逐渐成为国内除了明亮发光杆菌、费氏弧菌以外的毒性检测菌种。

关键词：青海弧菌；环境激素；毒性检测

1引言

随着工业革命的发展，人类开启了环境污染的加速时代[1]，目前人类的生存环境正面临日益严重的污染危机[2～4]。迄今为止，已经有约80000种化学物质存在日常用品以及食物当中，而且每年约新合成化学物质1500种。为了应对不同生物毒理学试验的选择，各个机构制定了不同的方法与标准[5]，现在通过美国EPA统计显示：ICCVAM机构总结出了63种测试方法；这些方法中美国执法机构认可60种；被其他机构采纳41种，欧盟认可并采纳47种[6]。针对水体中各种有毒有害污染物质，普通理化指标已经不能完全满足生态效应评价，与毒理学、医学、环境生态学、分析化学等学科交叉的环境毒理学应运而生[7,8]。现在人们开始从传统物质的毒性研究转移到潜伏期更长的环境激素类物质。

大多数环境激素都对动物和人类身体器官、生殖繁殖等有影响，严重时能通过多种途径使身体发生癌变以及婴儿先天畸形等[9]。环境激素一般毒性作用剂量小、潜伏时间长，常作用于神经系统、生殖系统、免疫系统、肝脏肾脏等；表现为对物种健康、生殖繁衍有巨大威胁。Our Stolen Future网站上最新公布的环境激素物质名录近百种。对于环境激素对人体作用研究，国内已经有学者做过一些环境激素毒理性相关研究，但在水体中低浓度环境激素毒性检测研究几乎还是空白。

2发光细菌法简介

发光细菌法是1978年Beckman仪器公司使用明亮发光杆菌为菌种与生物发光光度计结合的短期、经济、快速的测试方法。发光菌急性毒性检验方法是采用生物发光光度计进行生物毒性检验的毒理学方法之一，与传统毒性检测方法相比具有简便、快速、灵敏等优势，在环境毒理学中对环境污染物风险评价等方面有重要意义。在毒性测试方面应用的发光菌现在主要有：明亮发光杆菌[10]、费氏弧菌[11, 12]、青海弧菌[13～15]。1995年中国就颁布了适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的《水质急性毒性的测定发光菌法》(GB/T 15441-1995)国家标准。

青海弧菌是1985年中国学者朱文杰等从青海湖产的青海裸鲤体表分离到一种新型淡水发光菌，并命名为青海弧菌，其典型菌株是Q-67[15]。通过国内朱文杰、马梅、刘树深等的努力，建立了使用Q-67能与明亮发光杆菌相提并论的淡水发光菌毒性测试方法[13, 14]。此方法测定污染物质毒性是以Veritas T M微孔板光度计为发光强度测试设备，以有毒物质对发光菌发光强度抑制表征毒性大小的新方法。该法具有应用范围广、灵敏度高、相关性好、反应速度快、自动化程度高、人为错误少等优点；与明亮发光杆菌方法相比，具有无盐度干扰、pH范围广等特点[16]。

在水体环境中，物化指标并不能从整体上反映水质的好坏，尤其是对存在低浓度污染物质的水体，而且对于污染物的毒性来说，并不是取决于相关化学参数。普通水质指标已经不能完全满足水质对人体健康风险评价要求。在进行水体快速毒性评价时，选择有代表性的毒性测试方法和测试生物是非常有必要的，现在用的一般毒理性测试方法有：鱼类(斑马鱼)[17]、发光细菌[13]、海藻[18]、黑褐新糠虾[19]、底栖软体动物[20]等。

3青海弧菌研究

3.1基本研究

青海弧菌Q-67发现以来，很多学者对它进行了相关研究，极大地推动了其在相关领域的应用。郑敬民等通过实验探讨了环境因子对青海弧菌生长和发光的影响[21]，发现甘油对生长影响最大，氮对发光影响最大，并提出了比较合理的培养基配方。马梅在论文完成期间对pH值、菌液浓度、反应时间等因素对发光菌Q-67发光强度的影响做了相关研究[16]。刘清等对几种单质金属的联合毒性进行了研究[22]，初步探讨了两种物质之间的拮抗、加和以及协同作用。莫凌云等对5种取代酚化合物对淡水发光菌的联合毒性的研究中，还对单个取代酚化合物毒性进行了测试[23]。

3.2应用研究

从刘清等1997年利用Cu、Zn、Cd、Hg对青海弧菌(Q67菌株)联合毒性作用的研究开始，青海弧菌逐步应用于毒性测试研究[22]。现在已经对很多有毒单质物质进行过测试研究，还对无机、有机有毒化合物进行过研究。现在大多数学则都倾向于进行物质的混合毒性研究。如莫凌云等对苯酚与苯胺衍生物对发光菌的联合毒性[24]；肖菊等均匀设计用于研究硝基苯衍生物对青海弧菌Q67的联合毒性[25]；熊蔚蔚等等毒性配比法研究镉、铬和铅对淡水发光细菌的联合毒性[26]；其中刘树深团队建立化学混合物毒性评估与预测(APTox)的方法体系取得很好成功[27]。

青海弧菌Q-67 在环境激素物质方面研究比较少，一般都是以有毒物质进行研究而忽略了作为环境激素的影响。如：吴淑杭发光细菌法快速检测农产品中主要污染物联合毒性技术研究[28]；莫凌云等对苯酚与苯胺衍生物对发光菌的联合毒性[24]；王婧费氏弧菌和青海弧菌在抗生素检测技术中的应用研究[29]； 杨洁等11 种农药对淡水发光细菌青海弧菌Q67的毒性研究[30]，其中包含了多种环境激素类农药。

4展望

现在青海弧菌Q-67除了在土壤、大气、水的监测中使用外，在其他不同类型污染分析中也逐渐被使用： 单组分物质毒性；无机物、有机物毒性测试；多组分混合物质联合毒性等。马义兵等应用于土壤中Cu急性毒性的测试[31]；杨洁等使用Q-67对11种农药进行了毒性测试[30]；张瑾等对30种离子液体进行了毒性效应测试[32]；刘赟等进行了河流底泥毒性试验[33]。

青海弧菌Q-67的应用现在还只限于急性毒性方面，在其他毒性方面研究还落后于其他类发光细菌。顾宗濂等使用明亮发光杆菌T9171暗变种对土地处理后的工业废渣进行了致突变测试，取得了与传统Ames试验检测趋势相象的结果[34]；他们在发光细菌暗变种T9171对化合物的致突变效应灵敏度研究中发现其比Ames试验在致突变性检测更灵敏、快速[35]。宋一之等使用发光细菌基因luxCDABE与不动杆菌ADP1重组得到具有较高遗传稳定性并能测定环境样品遗传毒性的组合细菌[36]。

5总结

青海弧菌Q-67经过这些年的研究，在急性毒性检测方面与明亮发光杆菌以及费氏弧菌等常用菌属步调相差不大，在相关分子结构、基因等方向也开始进行研究。在用发光细菌对环境激素毒性以及“三致”、遗传毒性等方面，常用菌属都还不多。灵敏、快速、准确、廉价的遗传毒性测定，对研究全球日益不断的激素污染而言将会是一个极大的鼓舞。

参考文献：

[1]李宏图, 英国工业革命时期的环境污染和治理[J]. 探索与争鸣, 2009(2): 60～64.

[2]J Tölgyessy Editor.9 Human exposure to toxic and hazardous substances in water, air and soil (Environmental biochemistry and toxicology) [J]. in Studies in Environmental Science, 1993(11). 724～832.

[3]Court GS. Chlorinated hydrocarbons in the tissues of South Polar Skuas (Catharacta maccormicki) and Adélie Penguins (Pygoscelis adeliea) from Ross Sea[J]. Antarctica. Environmental Pollution, 1997，97(3):295～301.

[4]Vetter W. Organochlorine residues in two seal species from Western Iceland[J]. Science of The Total Environment, 1995,170(3):159～164.

[5]EPA. The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM)[R].EPA，2000.

[6]EPA. U.S. and International Acceptance of Alternative Methods, 1998-2012 Chronological List[R].EPA, 2012.

[7]Racz W J. On-line sources of toxicological information in Canada[J]. Toxicology, 2003，190(1-2):3～14.

[8]Pesch B. Challenges to environmental toxicology and epidemiology: where do we stand and which way do we go[J]. Toxicology Letters, 2004，151(1):255～266.

[9]Tilghman S L. Environmental hormones: Multiple pathways for response may lead to multiple disease outcomes[J]. Steroids, 2010,75(8-9):520～523.

[10]吴淑杭. 重金属汞、镉和铬对明亮发光杆菌的生物毒性[J]. 农业环境科学学报, 2011(12):2446～2450.

[11]Hernando M D. Combined toxicity effects of MTBE and pesticides measured with Vibrio fischeri and Daphnia magna bioassays[J]. Water Research, 2003，37(17):4091～4098.

[12]李翔. 黄曲霉毒素对费氏弧菌发光的影响[J]. 微生物学报, 2011(12):1669～1674.

[13]刘保奇. 测定环境污染物对青海弧菌发光强度抑制的微板发光法研究[J]. 生态毒理学报, 2006(2):186～191.

[14]马梅. 新型淡水发光菌(Vibrio qinghaiensis sp.——Q67)应用于环境样品毒性测试的初步研究[J]. 环境科学学报, 1998(1):88～93.

[15]朱文杰. 发光细菌一新种──青海弧菌[J]. 海洋与湖沼, 1994(3):273～279+353.

[16]马梅. 新的生物毒性测试方法及其在水生态毒理研究中的应用[D].北京：中国科学院研究生院(生态环境研究中心),2002.

[17]Massarsky A. Assessment of nanosilver toxicity during zebrafish (Danio rerio) development[J]. Chemosphere, 2013,92(1):59～66.

[18]冯鸣凤. 重金属对发光海藻Pyrocystis lunula的毒性研究——一种新型的快速生物毒性测试方法[J]. 生态毒理学报, 2010(4):531～536.

[19]周名江. 黑褐新糠虾的急性毒性测试方法及在钻井液毒性评价中的作用[J]. 海洋环境科学, 2001(3):1～4.

[20]Smolarz K, A Berger. Long-term toxicity of hexabromocyclododecane (HBCDD) to the benthic clam Macoma balthica (L.) from the Baltic Sea[J]. Aquatic Toxicology, 2009，95(3):239～247.

[21]刘保齐.测定环境污染物对青海弧菌发光强度抑制的微板发光法研究[J].生态毒理学报，2006(2):186～191.

[22]刘清. Cu、Zn、Cd、Hg对青海弧菌(Q67菌株)联合毒性作用的研究[J]. 中国环境科学, 1997(4):14～16.

[23]莫凌云. 5种取代酚化合物对淡水发光菌的联合毒性[J]. 生态毒理学报, 2006(3):259～264.

[24]莫凌云. 苯酚与苯胺衍生物对发光菌的联合毒性[J]. 中国环境科学, 2008(4):334～339.

[25]肖菊. 均匀设计用于研究硝基苯衍生物对青海弧菌Q67的联合毒性[J]. 环境科学研究, 2008(2):120～124.

[26]熊蔚蔚. 等毒性配比法研究镉、铬和铅对淡水发光细菌的联合毒性[J]. 生态环境, 2007(4):1085～1087.

[27]刘树深. APTox:化学混合物毒性评估与预测[J]. 化学学报, 2012(14):1511～1517.

[28]吴淑杭. 发光细菌法快速检测农产品中主要污染物联合毒性技术研究[D].上海华东师范大学,2007.

[29]王婧, 费氏弧菌和青海弧菌在抗生素检测技术中的应用研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学,2011.

[30]杨洁. 11种农药对淡水发光细菌青海弧菌Q67的毒性研究[J]. 环境污染与防治, 2011(4):20～24.

[31]韦东普. 应用淡水发光细菌测定土壤Cu急性毒性的影响因素研究[J]. 农业环境科学学报, 2009(7):1386～1391.

[32]张瑾. 30种离子液体对青海弧菌Q67的毒性效应[J]. 环境科学, 2011(4):1108～1113.

[33]刘赟. 苏州河底泥及河水生物毒性的研究[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2004(1):93～98.

[34]顾宗廉. 发光细菌暗变种对土地处理的工业废渣的致突变效应[J]. 环境科学学报, 1994(3):349～354.

[35]谢思琴. 发光细菌暗变种T9171对化合物的致突变效应灵敏度研究[J]. 环境科学学报, 1999(3):91～96.

[36]宋一之. 遗传毒性检测生物传感细胞的灵敏度及稳定性研究[J]. 清华大学学报(自然科学版), 2010(11):1880～1884+1889.

收稿日期：2016-04-19

作者简介：张超(1988—)，男，硕士，助理工程师，主要从事水污染控制、环境毒理学及环境影响评价工作。

中图分类号：X832

文献标识码：A

文章编号：1674-9944(2016)12-0095-03

Research Progress in Application of Freshwater Luminecent Bacteria Vibrio-qinghaiensis s p.-Q67 inToxicity Testing of Environment Hormones

Zhang Chao1,Wang Sha2,Deng Xiaoyun3

(1.AppraisalCenterofEnvironmentandEngineering,EnvironmentalProtectionBureauofTibetAutonomousRegion,LasaTibet850000,China;2.ChengduCerealsCo.Ltd.,ChengduSichuan611400，China;3.LivestockandFoodAuthorityofShehongCounty,ShehongSichuan629200,China)

Abstract:A new micro-plate luminomery forthe toxicity bioassay of environmental pollutant on the new freshwater luminecentbacteria, Vibrio-qinghaiensis s p.-Q67 as testingbiont, was developed using VeritasTM Microplateluminometer to measure the luminous intensity. With the studiesof freshwater luminescent bacteria Q-67 ongoing，apart fromPhoto-bacterium phosphorus and Vibrio-fischeri bacteria，it has become the major bacteria on Acute toxicity testing.

Keywords:Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67; environment hormones; toxicity testing