荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

王良玉，郭东星,2，蔚 然，辛德莉,2

(1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050；2.北京热带医学研究所，北京 100050)



荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

王良玉1，郭东星1,2，蔚 然1，辛德莉1,2

(1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050；2.北京热带医学研究所，北京 100050)

目的 建立Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法。方法 针对肺炎链球菌自溶素基因设计引物及探针，建立荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链球菌感染。采用肺炎链球菌标准株，构建质粒，用质粒构建标准品，扩增标准品，绘制标准曲线并检验新建荧光定量PCR的敏感性，采用本实验冻存其他菌DNA样本，检测其特异性；采集2015年9月至2015年12月份北京地区家5家医院儿童门诊或病房，诊断为呼吸道感染患儿的咽拭子标本133例，对新建荧光定量PCR法进行临床样本的验证。结果 绘制了荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链菌感染的标准曲线；新建荧光定量PCR可检测的肺炎链球菌最低拷贝数为10copies/μL；新建荧光定量PCR可成功区分几种病原体DNA，具有较好特异性；采用新建荧光定量PCR检测临床样本132例，其中肺炎链球菌阳性25例，阳性率为18.94%。结论 新建立的荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法具有较高的敏感性和特异性，可用于临床样本的检验。

肺炎链球菌；儿童呼吸道感染；实验室诊断方法；荧光定量PCR

肺炎链球菌(streptococcus pneumonia，SP)属于芽孢杆菌纲，链球菌属，可定植于呼吸道粘膜，与人类共生，无致病性。当呼吸系统防御功能及肺部正常清除功能受损时，可引起呼吸系统疾病[1]。肺炎链球菌是人类感染性疾病的重要病原体，据估计，全球范围内每年约有1 400万人感染肺炎链球菌，约100万人死于肺炎链球菌感染，其中儿童所占比例较高[2]。Rudan等[3]报道，肺炎仍是导致儿童死亡的首要病因，其中，由肺炎链球菌感染引起的死亡约占33%。肺炎链球菌所致疾病以肺炎为主，可继发脑膜炎，菌血症，中耳炎等其他疾病，对儿童健康构成较大威胁[4]。对肺炎链球菌感染的诊断，治疗及预防策略仍是比较重要的挑战。而及时准确的病原学诊断，对临床治疗药物的选择和治疗方案的制定起到十分重要的作用。

针对肺炎链球菌的诊断，细菌培养和普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法已用于可疑临床病例标本中肺炎链球菌的检测和病例的辅助诊断。传统的分离培养存在实验条件和人员要求较高，培养所需时间较长，易与草绿色链球菌混淆等问题，随着抗生素的广泛使用又给肺炎链球菌的培养增加了细菌培养难度[5]。目前我国肺炎病例的诊断多为临床诊断，缺乏病原学检测结果。分子生物学诊断技术，因其快速、敏感、特异等优点，越来越多的学者选择采用分子生物学方法诊断病原体感染[6-7]。本研究建立了一种Taqman 探针法荧光定量PCR，以期为肺炎链球菌感染的实验室诊断、流行病学调查提供一种快速、简便、易于推广的手段。

1材料与方法

1.1研究对象

采集2015年9月至2015年12月期间就诊于北京市儿童医院、北京朝阳医院等5家医院的儿童呼吸道感染患儿，咽拭子标本133例，冻存于-80℃冰箱备用。入组标准：①具有发热，伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染症状之一的患者，病程在1～7天的门诊和住院病人；②血常规：白细胞总数5.0～12.0×109/L，中性粒细胞<70%；③年龄6个月～14岁，性别不限。排除标准：①重症肺炎或出现多系统、多器官损害者；②患严重肝脏、肾脏、心血管及造血系统疾病、免疫系统疾病及精神疾病的患儿。

1.2研究方法

1.2.1引物及探针

针对肺炎链球菌自溶素基因序列，设计特异性引物SP-F/SP-R，及探针SP-P，引物及探针序列见表1。引物及探针均由美国Invitrogen公司合成，经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)方式纯化。

表1 引物及探针序列

Table 1 Primers and probe sequences

引物及探针名称序列SP-PTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGSP-FACGCAATCTAGCAGATGAAGCASP-RTCGTGCGTTTTAATTCCAGCT

1.2.2构建标准品

复苏并培养2015年4月购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection ATCC)ATCC的肺炎链球菌标准株，采用康为世纪高纯度质粒小提试剂盒 (PurePlasmid Mini Kit 货号：CW0500S，生产批号：20121)提取质粒，并对提取的质粒进行定量分析，之后10倍稀释，构建浓度梯度为107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL的质粒作为标准品，保存于-80℃备用。

1.2.3绘制标准曲线

以标准品为模板进行荧光定量PCR，绘制标准曲线。荧光定量PCR反应体系：2×Taqman缓冲液12.5μL，SP-F/SP-R 引物各0.5μL，Probe 0.5μL ，DNA 模板5.0μL，ddH2O 9μL，总体积28.0μL。反应条件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。采用ABI 公司荧光定量PCR 仪7500 的SDS 软件分析实验结果并绘制标准曲线。

1.2.4方法学验证

1.2.4.1灵敏性 采用冻存于-80℃的标准品，检测新建的荧光定量PCR的灵敏性。采用和绘制标准曲线时相同的反应体系和反应条件。

1.2.4.2特异性 采用本实验保存大肠杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人型支原体、肺炎克雷白菌和肺炎支原体标准株提取的质粒，检测新建实验方法的特异性。

1.2.4. 3临床样本检测 采用通用型柱式基因组提取试剂盒(生产厂家：北京康为世纪生物科技有限公司)提取采集的133例临床咽拭子样本的DNA。采用新建的荧光定量PCR法检测临床样本。反应体系和反应条件参照绘制标准曲线时选择的体系和条件。根据样本扩增的CT值判定阴性和阳性，Ct值<39结果判定为阳性。

2结果

2.1标准曲线

用SP-F/SP-R引物扩增标准品，以标准品浓度为横坐标，相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线如图1。标准曲线方程：Y=-3.3449X+40.9037，R2=0.999；模板量与Ct值具有良好的相关性，能够对模板定量。

注：模板拷贝量[log(copies/μL)]

图1 新建荧光定量PCR标准品扩增曲线

Fig. 1 Amplification curves of newly developed fluorescence quantitative PCR standard samples

图2 新建荧光定量PCR标准品扩增曲线

Fig. 2 Amplification curve of newly established fluorescence quantitative PCR standard smaples

2.2灵敏性

10倍梯度稀释肺炎链球菌标准株提取的质粒，检验新建荧光定量PCR的灵敏度。新建荧光PCR检测基因模板的最低拷贝数为10copies/μL。

2.3特异性

分别采用本实验保存大肠杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人型支原体、肺炎克雷白菌和肺炎支原体标准株提取的质粒，检测新建实验方法的特异性。结果显示新建荧光定量PCR的能成功区分以上几种病原体DNA，具有良好特异性。

2.4临床样本检测

用新建荧光定量PCR检测临床样本提取的DNA，结果显示，132例咽拭子标本，其中Ct值<39者有25例，判定为阳性，阳性检出率为18.94%。

3讨论

3.1建立儿童肺炎链球菌感染实验室诊断方法的必要性

肺炎链球菌主要寄居在人的鼻咽部，是社区获得性肺炎的常见致病菌之一，儿童、老年人等免疫力相对较差的人群是主要感染的人群。在中国儿童社区获得性肺炎中13%～53%是肺炎链球菌引起，也是<5岁儿童肺炎链球菌感染引起死亡病例最多的国家之一[8]。目前病原学检查，可以诊断60%以上的社区获得性肺炎的感染病原[9]。但现有的诊断方法仍存在一定问题，满足不了临床需求。常采用的诊断肺炎链球菌感染的方法为分离培养法，但由于其影响因素较多，不利于临床及时快速诊断，给治疗带来一定困难[10]。因此需要进一步探讨研究更为快速，灵敏、经济、操作简单，易于推广的诊断方法。

3.2本研究方法诊断肺炎链球菌感染的优势

由于分子生物诊断方法具有快速、简便、灵敏性特异性均较高的优势，近年来，越来越受到国内外学者的青睐。本研究建立了敏感、快速的Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的方法，以辅助临床诊断。新建的实验室诊断方法能检测的最低拷贝数为10copies/μL，采用本实验室保存的大肠杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人型支原体、肺炎克雷白菌和肺炎支原体标准株提取的质粒，验证了实验方法的特异性，结果显示能区分上述病原体，说明本方法不存在交叉反应，具有良好特异性。另外，Taqman探针法因其具有序列特异性，只与互补区结合，荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，灵敏度高，条件优化容易[11]；操作简单用时较短，有助于临床快速做出诊断，及时选择合适抗生素，尽快制定出准确合理的治疗方案。张亚维[12]的研究报道中认为荧光定量PCR优于传统培养。曹东林等[13]同样建立了Taqman探针法荧光定量PCR肺炎链球菌感染的方法，并将其与传统的分离培养进行比较，发现荧光定量PCR敏感性优于分离培养。而本次建立的荧光定量PCR检测的最低拷贝数为10 copies/μL，敏感性更高于曹东林等建立的诊断方法。完成实验方法的优化和验证后，将本方法应用于临床样本的检验，检测临床样本132例，测得肺炎链球菌感染25例，阳性率为18.94%。与曹东林等的检出率基本一致。

综上所述，认为本方法具有较高的敏感性、特异性。可以作为临床诊断肺炎链球菌感染、进行流行病学调查等的一种辅助手段。

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[专业责任编辑：侯 伟]

Developing a fluorescent quantitative PCR method for detection of streptococcus pneumonia infection

WANG Liang-yu1, GUO Dong-xing1,2, WEI Ran1, XIN De-li1,2

(1.Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China;2. Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing 100050, China)

Objective To develop a Taqman probe fluorescence quantitative PCR assay for detection of streptococcus pneumonia (SP). Methods Primer and probe were designed according to SP autolysin and fluorescence quantitative PCR Taqman probe were established to detect SP infection. The standard plasmids extracted from SP standard strains were used to constitute and amplify standard samples. The sensitivity of the fluorescence quantitative PCR assay was tested by established standard curves. The specificity of fluorescence quantitative PCR assay was tested by the DNA samples of other bacteria frozen in the laboratory. Meanwhile, 133 throat swab samples from inpatients and outpatients children diagnosed as respiratory infection were collected from 5 hospitals in Beijing area from September 2015 to December 2015 to validate the fluorescence quantitative PCR assay. Results The standard curve of fluorescence quantitative PCR Taqman assay detecting SP was made. This newly-developed method could detect at least 10 copies of SP, and could successfully distinguish several DNAs of the pathogens with good specificity. Newly developed fluorescence quantitative PCR was used to detect 132 clinical samples, including 25 positive SP with positive rate of 18.94%. Conclusion The fluorescence quantitative PCR assay is of great sensitivity and specificity, and it can be widely used for the detection of SP.

streptococcus pneumonia (SP); respiratory tract infections in children; laboratory diagnostic method; fluorescence quantitative PCR

2016-08-22

国家自然科学基金资助项目(编号：81271890)

王良玉(1989-)，女，在读硕士研究生，主要从事儿科学的研究。

辛德莉，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.006

R725.6

A

1673-5293(2016)10-1184-03