UPLC-DAD法同时测定刺五加叶中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四种成分的含量

翟春梅，史连宏，陈忠新，王知斌，孟永海*

(1.黑龙江中医药大学，北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)



质 量 工 艺

UPLC-DAD法同时测定刺五加叶中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四种成分的含量

翟春梅1,2，史连宏1,2，陈忠新1,2，王知斌1,2，孟永海1,2*

(1.黑龙江中医药大学，北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：建立UPLC同时定量刺五加叶药材中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin等4种有效成分的方法。方法:色谱柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱条件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；紫外检测波长：360 nm。结果：对9批产地的刺五加叶药材进行测定，绿原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；芦丁含量最高的是鸡东(0.122 mg/g)；金丝桃苷含量最高的是宾县(0.528 mg/g)；异槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)。结论：该方法可用于刺五加叶中四种成分的含量测定，本研究所建立的方法稳定性、精密度、重复性良好，适用于刺五加叶的含量测定；不同来源的药材成分含量差异显著，对刺五加实施多指标的含量控制是保证其临床药用安全可控的必要途径。

刺五加叶；UPLC-DAD；绿原酸；芦丁；金丝桃苷；异檞皮苷

中药“刺五加” (根茎)自古即被视为具有添精补髓及抗衰老作用的良药，主要用于治疗风湿痹痛，腰膝酸痛等证。现代研究其具有抗疲劳、抗癌、抗心律失常、降血糖等作用。然而，由于刺五加食用药用价值均高，长期以来一直被掠夺式的采挖，致使野生资源遭到了严重破坏，1992年中国植物红皮书已将刺五加列入渐危物种。然而如何使刺五加物尽其用，又能保护其资源呢？刺五加叶资源丰富、可再生，大部分刺五加叶自生自灭，至今无人利用。我国学者对刺五加叶进行了治疗糖尿病药理学研究[1-7]，发现其具有良好的治疗糖尿病活性。叶中主要含有皂苷类、黄酮类和酚酸类等成分，与其根茎中的成分大部分类似[8]，黄酮及酚酸类成分中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、绿原酸等成分含量较高。本研究釆用超高效液相色谱法并结合超高效液相色谱柱，在10 min内同时测定了刺五加叶中这四种主要成分的含量，并进行了全面的方法学考察。本研究建立了一种快速、有效地控制刺五加叶的质量的方法。

1 实验仪器和材料

ACQUITYTMUPLC超高效液相色谱系统，Xevo QTof MS质谱系统(美国Waters公司)，采用电喷雾离子源(ESI)、二元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱。数据采集与处理采用Masslynx 4.1软件。数控超声波清洗器(型号：KQ-500DB，昆山市超声仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Milli‐Q 纯水器(密理博上海贸易有限公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司)；对照品金丝桃苷(批号111521-200303，含量≥98%,HPLC) 购于中国药品生物制品检定中心。对照品绿原酸(批号110753)，芦丁(批号MUST-14102301)， 异槲皮苷(批号MUST-14070211)均购于成都曼斯特生物科技有限公司。

刺五加叶药材购自黑龙江省绥芬河地区，经黑龙江中医药大学药学院中药鉴定教研室王振月教授鉴定为五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harm)的干燥叶。

图1 绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的化学结构式

2 方法与结果

2.1 标准品与供试品溶液的制备

精密称取对照品(经减压干燥至恒重)绿原酸5.06 mg，芦丁4.12 mg，金丝桃苷6.19 mg，异槲皮苷5.08 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇分别配置成浓度为506 μg/mL，412 μg/mL,619 μg/mL,508 μg/mL的单一对照品储备液。再将储备液制成6个浓度的混合标准品溶液，构建成标准曲线。将刺五加叶药材干燥并粉碎，过0.9 mm筛后用石油醚浸泡后超声30 min，弃去浸提液，再加石油醚超声，反复多次至浸提无色，使叶绿素完全除去后倾去浸提液，将药材残渣置于通风处干燥。精密称取2 g药材粉末置具塞锥形瓶中并向其中加入50 mL甲醇，密塞并称定其重量，浸泡2 h后，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，放冷后，称定其重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀并滤过，滤液为供试品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性

色谱柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱条件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；检测波长：360 nm。甲醇按上述色谱法测定，结果表明溶剂对绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的测定无干扰。见图2。

图2 样品(A)、对照品(B)空白对照色谱图(C)注：1.绿原酸(Chlorogenic acid);2.芦丁(Rutin);3.金丝桃苷(Hyperoside);4.异槲皮苷(Isoquercitrin)。

2.3 线性关系考察

精密吸取上述2.1制备的储备液配制成不同浓度的对照品溶液，按照2.2色谱条件项下进行测定，进样体积为5 μL。以进样浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果线性关系良好，见表1。

表1 Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin标准曲线方程

2.4 精密度试验

日内精密度：分别精密吸取三个不同浓度的含有绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的混合对照品溶液5 μL，重复进样3次测定峰面积，代入标准曲线计算出浓度，计算浓度的RSD值。

日间精密度：分别精密吸取三个不同浓度的对照品溶液5 μL，连续进样3天测定峰面积，代入标准曲线计算出浓度，计算浓度的RSD值。结果绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷浓度的 RSD均小于5%，表明精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取同一批刺五加叶药材9份，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，包括高、中、低三个不同的浓度并且每个浓度一式三份，进行测定，记录峰面积，计算含量。结果显示绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷浓度的RSD均小于5%，说明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别于0、2、4、6、8、12和24 h进样，记录色谱峰面积，分别按样品含量测定法测定。结果显示绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷峰面积的RSD均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品，分别加入绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，包括高、中、低三个不同的浓度并且每个浓度一式三份，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。(测得值-样品中含量)/加入量×100%。结果显示绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的加样回收率RSD均小于5%，表明该方法的准确度良好。

2.8 样品含量测定

结果表明该方法可用于刺五加叶中四种成分的含量测定，并对9批产地的刺五加叶药材进行测定，结果(见表2)发现9批产地中，绿原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；芦丁含量最高的是鸡东(0.122 mg/g)；金丝桃苷含量最高的是宾县(0.528 mg/g)；异槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)；综合考虑，质量最优的产地是五常，是为进一步的药理研究及中药药效物质研究提供依据。

表2 9批产地的刺五加叶中四种成分的含量测定

3 讨论与小结

3.1 供试品溶液的制备方法的选择

用超声提取法提取，考察了提取溶剂甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、60%乙醇，结果以50%乙醇提取率最高，故提取溶剂选择50%乙醇。对提取时间(30 min，60 min，90 min)，提取次数(1次，2次)因素进行考察，用50%乙醇50 mL提取时间90 min，提取2次的提取率最高。

3.2 色谱条件的选择

考察了甲醇-水，乙腈-水系统在不同的梯度下并向其中加入不同比率的甲酸，乙酸及甲酸铵。发现乙腈-水系统并分别向其中加入0.1%甲酸为最优条件。此条件下峰形较好，分析时间短，高分离度，柱压低。选择合适的梯度是分离的关键，因为本实验中金丝桃苷和异槲皮苷是同分异构体，极性非常相似，比较难分离。曾有文献研究通过高效液相色谱法分离这两种化合物，但分离的时间较长，条件繁琐。本实验采用超高效液相色谱，简单、快速地将其基线分离并准确测量出其含量。

3.3 小结

本章建立了一种灵敏度高、稳定性好、简单快速的UPLC-DAD的含量检测方法。主要是对刺五加叶中绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的含量测定方法，并对该方法进行了系统的方法学考察，结果表明该方法可用于刺五加叶中四种成分的含量测定，为进一步阐明开发刺五加叶提供实验依据。

[1] 睢大筼,吕忠智,李淑慧,等.刺五加叶皂甙降血糖作用[J].中国中药杂志,1994,19(11):683-6851.

[2] 睢大筼,吕忠智,于晓凤.刺五加叶皂甙的抗应激作用研究[J].人参研究,1996,8(11):34-36.

[3] 倪劲松,吴家祥,肖纫秋,等.刺五加皂甙对糖尿病大鼠血过氧化脂质和超氧化物歧化酶的影响[J].白求恩医科大学学报,1998,24(1):33-34.

[4] 王杰,田刚,刘立刺,等.五加叶皂甙对免疫功能的影响[J].人参研究,1997,9(3):35-36.

[5] 王柏欣,王淑湘,谭宏,等.刺五加叶皂甙对糖尿病大鼠脂质过氧化物的作用[J].黑龙江医药科学,2004,27(2):1-2.

[6] 扈清云,李艳君,王景涛,等.刺五加叶皂甙对II型糖尿病大鼠胰岛素分泌影响的形态学研究[J].黑龙江医药科学,2003,26(6):21-22.

[7] 赵晓莲,关政.刺五加叶皂甙对糖尿病大鼠视网膜超微结构的影响[J].黑龙江医药科学,2003,26(6):59.

[8] Huang LZ,Zhao HF,Huang BK,et al.Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology[J].Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences,2011,66(2):83-97.

UPLC-DAD Method for Quantification on Chlorogenic Acid, Rutin,Hyperoside and Isoquercitrin in Extract of E.Senticosus Leaf

ZHAI Chun-mei1,2,SHI Lian-hong1,2,CHEN Zhong-xin1,2,WANG Zhi-bin1,2,MENG Yong-hai1,2*

(1.KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation)HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineandNaturalMedicinePharmacodynamicMaterialBasesResearchinHeilongjiangProvince,Harbin150040,China)

Objective:To establish the UPLC-DAD method for quantification on Chlorogenic acid, Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in extract of E. senticosus leaf. Methods:Column: HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm, Waters); Column temperature: 40℃; Flow rate: 0.4 mL/min; Injection volume: 5 μL; Mobile phase A: 0.1% aqueous formic acid, Mobile phase B: acetonitrile; Gradient elution conditions: 0-8 min: 88%-75%A,8-9 min: 75%-88%A,9-10 min: 88%-88%A. Detection wavelength: 360 nm. Results：Totally 55 compounds including triterpenoid saponins, flavonoid glycosides, organic acids and other compounds were identified by Scifinder database and reference literatures in the optimized LC-MS conditions. Conclusion：It is a fast, accurate and comprehensive method to identify the chemical ingredients of E. senticosus leaf by UPLC/Q-TOF-MS/MS.

E.senticosus leaf; UPLC-DAD;Chlorogenic acid;Rutin;Hyperoside;Isoquercitrin

黑龙江省青年科学基金项目(No.QC2012C064)；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目(No.2012RCQ16)

翟春梅(1978-)，女，中药学博士，高级实验师，主要研究方向：中药药效物质基础研究。

孟永海*(1978-)，男，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药药效物质基础研究。

2016-04-11

R28

A

1002-2406(2016)05-0052-03

修回日期：2016-05-04