抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对溃疡性结肠炎小鼠发病的干预机制研究

王柏涛，张启芳，邱小芬，杨红杰，孟云超，郑 奕

抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对溃疡性结肠炎小鼠发病的干预机制研究

王柏涛1，张启芳2，邱小芬3，杨红杰4，孟云超2，郑 奕2

目的 探讨抗巨噬细胞移动抑制因子单抗(抗MIF单抗)对小鼠急性溃疡性结肠炎(UC)发病的干预作用及其可能调控机制。方法 以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导制备小鼠急性UC模型，小鼠分为正常组、UC模型组、抗MIF单抗干预组和生理盐水组。造模及药物干预期间观察小鼠一般情况并行疾病活动指数(DAI)评分，7 d后断颈处死全部小鼠，行结肠大体损伤评分，HE染色后光镜下观察结肠病理改变，免疫组化染色观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等促炎因子在结肠组织炎症细胞的表达情况，实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测结肠组织核因子-κβ(NF-κβ) p65 mRNA的表达水平。结果 与正常组相比，其余三组小鼠结肠炎症病变明显，MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，干预组结肠黏膜损伤程度减轻，抗MIF单抗显著改善MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表达水平(P<0.05)，而生理盐水组与其差异无统计学意义(P>0.05)。real-time PCR结果显示应用抗MIF单抗的小鼠能显著抑制结肠组织NF-κβ p65 mRNA的表达水平。结论 抗MIF单抗对小鼠UC的发病有明显的干预作用，可能通过抑制NF-κβ信号通路，减少促炎因子的表达发挥作用。

抗巨噬细胞移动抑制因子单抗；葡聚糖硫酸钠；溃疡性结肠炎；炎症因子；核因子-κβ

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及结肠黏膜及黏膜下层的非特异性自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未明确。肠道黏膜免疫耐受的异常表达和细胞因子的失衡与UC的发病密切相关，其中因NF-κβ作为一种多向转录调节因子，可以促使效应细胞分泌多种炎症因子，从而被证实在UC的发病中起重要作用[1]。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种特殊结构的炎症趋化因子，通过抑制巨噬细胞的游走、移动，促使巨噬细胞在炎症部位聚集、增生，从而发挥其促炎作用。既往研究[2]已证实其作为促炎因子参与UC的发病。因此该研究通过对小鼠结肠组织的检测，评价应用抗MIF单抗抑制MIF促炎作用后对小鼠结肠的炎症浸润情况，及各组小鼠MIF、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子和核因子-κβ(nuclear factor-κβ，NF-κβ)p65 mRNA在结肠组织的表达水平，旨在证实抗MIF单抗对UC的保护作用及其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级雄性BALB/c小鼠40只，鼠龄8～9周，(24±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物公司。适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、UC模型组、抗MIF单抗干预组、生理盐水组，每组10只。

1.2 药品与试剂 抗MIF单抗购自重庆探生科技有限公司；葡聚糖硫酸钠(DSS, MW 36 000～50 000)购自美国MP Biomedicals生物医学公司；MIF多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗TNF-α多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；IL-6多克隆抗体购自美国Bioworld公司；二抗HRP鼠兔通用型购自广州安必平医药科技有限公司；TRIzol A+总RNA提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV逆转录试剂盒购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 模型制备及药物干预 正常对照组自由饮水，其余三组每日饮用5 % DSS溶液连续 7 d。抗MIF单抗(4 mg/ml)与生理盐水1 ∶3体积比稀释后，抗MIF单抗干预组与生理盐水组于1、2、4、6 d分别腹腔注射抗MIF单抗和生理盐水0.2 ml/只。造模及给药期间观察并记录各组小鼠体重变化、精神状态、毛色、粪便性状等一般情况，并根据Cooper的经典评分方法[3]，进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分。

1.5 实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR) TRIzol法提取各组小鼠结肠组织的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行完整性分析，紫外分光光度计进行逆转录定量。β-actin引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司设计合成，NF-κβ引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，引物序列见表1。扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循环40次。反应结束后采用2-ΔΔCt法对结果进行分析，以β-actin为内参校对NF-κβ的相对表达量。

表1 基因引物序列

2 结果

2.1 小鼠一般情况 正常对照组小鼠毛色亮泽、顺滑，反应迅捷，体重均不同程度增加，粪便成条形、无便血和腹泻现象；与正常对照组对比，UC模型组和生理盐水组小鼠毛色混杂、无光泽、严重者毛发干枯，反应迟滞，活动度明显减低，出现拱背、扎堆现象，体重下降明显，粪便稀样、次数增多、便血严重；抗MIF单抗干预组小鼠毛色较正常对照组略黯淡、部分稍显杂乱，但不如模型组和生理盐水组明显，精神状态良好，体重减轻幅度小，部分小鼠出现轻微便血现象。

2.2 小鼠DAI评分 与正常对照组相比，其余三组差异有统计学意义(P<0.05)，表明模型制备成功；与抗MIF单抗干预组相比，UC模型组和生理盐水组差异均有统计学意义(P<0.05)；而UC模型组和生理盐水组间差异无统计学意义(P>0.05，F=28.910)。见表2。

2.3 结肠大体损伤评分 肉眼观察正常对照组小鼠结肠无充血水肿、无出血点，肠壁均匀光滑，血管清晰；UC模型组和生理盐水组结肠肠壁充血水肿、色泽晦暗，局部出现明显溃疡，伴有糜烂，与周围组织粘连，管壁有僵硬感；抗MIF单抗干预组小鼠结肠肠壁色泽暗淡，充血水肿，出现微小出血点，但其范围、程度、溃疡个数均不及UC模型组和生理盐水组显著(F=31.494)。见表2。

表2 小鼠DAI评分及结肠大体损伤评分(分，

与正常对照组比较：*P<0.05；与UC模型组比较：#P<0.05；与抗MIF单抗干预组比较：▲P<0.05

2.4 HE染色组织学评分 正常对照组小鼠结肠黏膜及黏膜下层结构完整无缺损，上皮细胞排列整齐，腺体形态规则，浆膜层血管无充血现象；UC模型组结肠黏膜上皮糜烂严重，黏膜固有层大部分腺体结构破坏，肉芽组织形成，提示可能曾存在浅溃疡，黏膜固有层及黏膜下层被大量炎症细胞浸润；抗MIF单抗干预组结肠黏膜上皮无糜烂，腺体结构正常，血管内红细胞聚集，呈充血现象，黏膜固有层炎症细胞浸润，但炎症细胞数量及浸润深度不及UC模型组和生理盐水组；生理盐水组结肠黏膜上皮缺损、断裂，轻度糜烂，炎症细胞主要集中在黏膜固有层(F=58.456)。见图1、表3。

2.5 免疫组化结果 各组小鼠结肠黏膜腺上皮均不表达MIF、TNF-α、IL-6。正常对照组结肠黏膜炎症细胞不表达或极微量表达；而在UC模型组和生理盐水组中，结肠黏膜炎症细胞均强表达；抗MIF单抗干预组中结肠黏膜炎症细胞MIF、TNF-α、IL-6呈弱表达，介于正常对照组和其余两组之间；MIF、TNF-α、IL-6的F值依次为766.448、308.356、1 626.643。见图2～4、表3。

图1 小鼠结肠组织病理切片 HE×200

2.6 real-time PCR结果 UC模型组小鼠结肠组织 NF-κβ p65 mRNA相对表达量(2.011±0.137)显著高于正常对照组(1.01±0.018)与抗MIF单抗干预组(0.84±0.211)，差异均有统计学意义(P<0.05)；与UC模型组相比，抗MIF单抗干预组的相对表达量较低(P<0.05)，而生理盐水组(2.00±0.12)与其差异无统计学意义(P>0.05)；抗MIF单抗干预组的相对表达量较正常对照组略低，二者差异无统计学意义(P>0.05)；F=63.658。

图2 小鼠结肠组织MIF 的表达 SP×200

图3 小鼠结肠组织TNF-α的表达 SP×200

分组病理评分阳性细胞率(%)MIFTNF⁃αIL⁃6正常对照0．30±0．48#▲8．10±1．32#▲7．97±1．59#▲11．10±1．32#▲UC模型13．60±1．17∗▲59．00±1．23∗▲60．40±2．40∗▲85．83±1．96∗▲抗MIF单抗干预6．30±1．16∗#22．17±1．51∗#30．53±1．74∗#55．27±1．78∗#生理盐水13．90±1．52∗▲59．00±1．22∗▲60．63±3．08∗▲83．90±2．75∗▲

与正常对照组比较：*P<0.05；与UC模型组比较：#P<0.05；与抗MIF单抗干预组比较：▲P<0.05

图4 小鼠结肠组织IL-6的表达 SP×200

3 讨论

UC发病率在我国呈明显上升趋势[6]，随着抗TNF-α类新型制剂的成功运用[7]，尝试生物制剂治疗UC已成为当前研究领域的热点。而MIF作为近年发现的多效能细胞因子，在机体内广泛存在，被认为是TNF-α、IL-6等参与UC发病的炎症因子的上游调控因子。因此该实验通过应用抗MIF单抗抑制MIF的表达，评价抗MIF单抗是否对小鼠UC能起到显著的保护作用。

本实验通过DSS诱导制备小鼠急性UC模型，发现应用抗MIF单抗的小鼠较UC模型组而言，小鼠的体重减轻幅度、粪便性状、结肠的大体损伤、光镜下结肠组织病理改变等均有显著改善，免疫组化染色观察MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表达也不同程度的下降。这就证明抗MIF单抗对小鼠UC的发病的确能起到保护作用。

近年来在对UC发病机制的研究中，发现TLR4/NF-κβ 信号通路与UC的发病密切相关，主要通过TLR4→ Myd88 → IRAK → TRAF → NIK → IKK → NF-κβ发挥作用[8-11]。而NF-κβ已被证实可以激活参与UC发病的TNF-α、IL-6等促炎因子的启动子[12]，当这些炎症因子释放后，反过来可再次正反馈调节NF-κβ的表达[13]，如此则形成“级联效应”，炎症不断放大。

本实验通过real-time PCR检测小鼠结肠组织 NF-κβ p65 mRNA的表达，发现应用抗MIF单抗的小鼠较UC模型组而言，其 NF-κβ p65 mRNA的表达水平显著下降，证实抗MIF单抗可能通过抑制NF-κβ的表达，进而减少NF-κβ下游信号通路炎症因子的含量发挥其干预作用。但本研究显示应用抗MIF单抗干预的小鼠，其 NF-κβ p65 mRNA的表达略低于正常对照组，理论上如果单纯通过TLR4-NF-κβ信号通路发挥作用，那么抗MIF单抗干预组的结肠组织学评分、阳性细胞率的表达等检测指标均应与正常对照组的表达水平相一致。因此，该研究也证实了有不同的信号通路参与UC的发病。

本次实验从分子信号转导通路层面对抗MIF单抗对小鼠UC可能产生的干预作用进行了探讨，初步判定抗MIF单抗通过抑制NF-κβ信号通路及其下游炎症因子的表达发挥作用，对其可能作用通路进行了大胆推测，肯定了抗MIF单抗的疗效。但是关于UC的信号通路是一个多因素参与的复杂网状结构，可能存在着分子间的重叠交叉激活，参与UC发病的很多关键的因子及其机制也尚未明确，且本次实验采用的小鼠样本量较少，故现阶段很难对抗MIF单抗对UC的保护作用有一个全面的定性，尚须进一步研究。

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Wang Baitao1，Zhang Qifang2，Qiu Xiaofen3，et al

The protective effect of anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody on ulcerative colitis in mice

(1Dept of Graduate School, Guilin Medical College，Guilin 541004；2Dept of Gastroenterology，3Dept of Pathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Guilin541002)

Objective To investigate the protective effect and possible regulatory mechanism of anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody(anti-MIF Ab)on acute ulcerative colitis(UC) in mice. Methods Acute ulcerative colitis model in mice was established by dextran sulfate sodium(DSS), to observe the protective effect of anti-MIF Ab on ulcerative colotis in mice. The experiment was divided into normal group, UC model group, anti-MIF Ab intervention group and saline group. During modeling and the period of administration, to observe general situations and score Disease Activity Index(DAI) of mice, after 7 days, all mice were killed, performing the gross damage score in colon, observing the colonic histopathological changes under the light microscope on HE staining, viewing the expression conditions of serum inflammatory cytokins such as MIF，TNF-α，IL-6 in intestinal inflammatory cells on immunohistochemical staining, using real-time quantitative(real-time PCR) to analyze the expression levels of NF-κβ p65 mRNA in colon tissue. Results Compared with the normal group, the degrees of colonic inflammation were significantly severe in the other three groups, the expression levels of serum inflammatory cytokines such as MIF，TNF-α，IL-6 were remarkably increased(P<0.05); compared with the model group, the degrees of colonic mucosa damage were alleviated in intervention group. Anti-MIF Ab could obviously improve the expression levels of serum inflammatory cytokines such as MIF, TNF-α, IL-6(P<0.05), but no significant differences between saline group and model group. The results of real-time PCR showed that mice using anti-MIF Ab could apparently inhibit the expression level of NF-κβ p65 mRNA. Conclusion Anti-MIF Ab has a strongly protective effect against ulcerative colitis in mice, maybe the inhibition of NF-κβ signal pathway and the decreasion of inflammatory cytokines play a central factor resulting from this conclusion.

anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody；dextran sulfate sodium； ulcerative colitis；inflammatory factor；nuclear factor-κβ

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.016.html

广西医疗卫生重点科研课题(编号：重2011018)；桂林市科学研究与技术开发计划项目(编号：科技攻关20140120-7-2)

1桂林医学院研究生学院，桂林 541004

广西壮族自治区南溪山医院2消化内科、3病理科、4中医科，桂林 541002

王柏涛，男，硕士研究生；

张启芳，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zhangqifang-gl@163.com

R 574.1

A

1000-1492(2016)01-0031-05

2015-09-30接收