PDA/SiO2大孔复合材料固定化荧光假单胞菌脂肪酶

白文静　李　云　曹大丽　吴燕飞　梁云霄

(新型功能材料及其制备科学国家重点实验室培育基地，宁波大学材料科学与化学工程学院，宁波315211)

PDA/SiO2大孔复合材料固定化荧光假单胞菌脂肪酶

白文静李云曹大丽吴燕飞梁云霄＊

(新型功能材料及其制备科学国家重点实验室培育基地，宁波大学材料科学与化学工程学院，宁波315211)

以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制备SiO2大孔材料，通过多巴胺在SiO2大孔材料孔道表面的原位聚合制得聚多巴胺表面功能化修饰的二氧化硅大孔材料(PDA/SiO2)。应用SEM、EDX、MIP、BET、TG-DTA和FTIR等技术对修饰前后的材料进行表征。以PDA/SiO2为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)，优化固定化条件并对比游离脂肪酶和固定化脂肪酶的性质。结果表明SiO2大孔材料具有三维连续贯通的孔道结构，孔径分布在300～500 nm，聚多巴胺修饰后形成聚多巴胺/二氧化硅复合纳米薄膜构筑的大孔材料。在固定化时间为14 h、pH值为8、初始脂肪酶浓度为0.4 mg·mL-1时，固定化效果最佳，酶活回收率达246%。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶有更宽的温度和pH适用范围、热稳定性显著提高，并展现出良好的储存稳定性和操作稳定性，固定化脂肪酶的Km低于游离脂肪酶的，酶与底物的亲和性较好。

SiO2大孔材料；功能化修饰；聚多巴胺；固定化；荧光假单胞菌脂肪酶

0　引言

脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)是一类酰基水解酶，具有催化高效性、高选择性以及催化底物较宽泛等特性[1-2]，在医药卫生[3]、食品工业[4-5]和化学化工[6-7]等领域有重要的应用。游离脂肪酶易受环境影响变性失活、难以回收、不易循环利用，固定化脂肪酶不仅保留了游离酶的活性和高选择性，而且稳定性好、成本低、易从反应体系中分离、便于重复使用[8]，具有更广阔的应用空间。

载体的选择是影响固定化酶性能的主要因素之一。多孔材料通常有较大的比表面积，常用于固定化酶[9]。尤其是介孔材料因具有高比表面积、酶的固载量大等优点，将其应用于固定化脂肪酶已得到了广泛的研究[10]。在多孔载体内部酶的固定化需要经历一个缓慢的扩散过程，孔径大小对酶的固定化至关重要[11]，较小的孔径由于孔道尺寸的限制，对酶和底物存在较大的传质阻力[12-13]，酶难以渗透进孔道内部而仅吸附于材料表面。Li等[14]在研究聚苯乙烯微球孔径大小对固定化脂肪酶性能的影响时发现：介孔微球的比表面积(745 m2·g-1)比大孔微球的(19 m2· g-1)大得多，固载量也最大，但大孔微球固定化脂肪酶的酶学性能最好。大孔材料的比表面积通常比介孔材料的小很多，但用大孔材料固定化酶有以下优点：由于孔径大从而减小了酶在固定化过程中的传质阻力；在固定化酶催化底物反应时，底物更容易接近酶的活性位点；便于表面功能化修饰引入活性基团[15]，包括用功能高分子进行修饰[16]。多巴胺(DA)能够在碱性条件下氧化发生聚合反应，形成强力粘附于载体表面的聚多巴胺(PDA)层[17-18]，反应过程温和，无毒无害且聚多巴胺富含功能基团，生物相容性好，具有共价连接亲核基团的能力[19]。Ren等[20]用PDA修饰磁性氧化铁纳米颗粒用于固定化脂肪酶，提高了脂肪酶的活性和稳定性。

本研究首先以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制得块体SiO2大孔材料，通过DA原位聚合使PDA均匀地粘附在SiO2大孔材料的孔壁上制得PDA修饰的二氧化硅大孔材料(PDA/SiO2)，该大孔材料由PDA和二氧化硅复合纳米薄膜构筑而成，既具有无机材料机械强度高、优良的热稳定性和化学稳定性等特点又结合了高分子涂层表面富含功能基团等优点，预期可以作为固定化酶的优良载体。应用SEM、MIP、BET、EDX、TG-DTA和FTIR等技术对制备材料进行表征；以PDA/SiO2为载体固定化荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)，优化了脂肪酶的固定化条件，并对比了游离脂肪酶和固定化脂肪酶的相关性质。

1　实验部分

1.1SiO2大孔材料的制备

将32 g环氧树脂，58 g聚乙二醇1000和10 g聚乙二醇2000混合，加热搅拌熔化为澄清溶液，在剧烈搅拌下迅速加入9.3 g三乙烯四胺，将澄清溶液倒入聚四氟乙烯浅盘中，70℃下反应2.5 h。取出白色聚合物后将其切割为粒径为2～3 mm的块体，用水充分浸泡洗涤除去PEG，室温下真空干燥12 h，得到具有三维骨架结构的大孔聚合物。将块状聚合物浸入正硅酸四乙酯中3 h，滤出后，50℃下在NH3·H2O气氛中放置12 h，使正硅酸四乙酯充分水解为SiO2，将得到的复合物在60℃下干燥2 h后置于马弗炉中以5℃·min-1的速度升温至600℃，并持续煅烧3 h，即得块体SiO2大孔材料。

1.2PDA/SiO2大孔复合材料的制备

用去离子水配制浓度为0.8 mg·mL-1的多巴胺溶液，加入干燥的块体SiO2大孔材料，振荡、充分浸泡后，用0.1 mol·L-1pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液调节溶液pH值为8.5，置于恒温水浴摇床中25℃下反应12 h，用去离子水多次洗涤除去未附着在大孔材料上的聚多巴胺，30℃真空干燥5 h，得到PDA/SiO2。

Scheme 1 Schematic description of surface modification of macroporous SiO2by the polydopamine coating and subsequent lipase immobilization on PDA/SiO2

1.3PFL的固定化

用0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液溶解PFL配置不同浓度的酶溶液，取0.1 g PDA/SiO2置于10 mL脂肪酶溶液中，在35℃、转速为100 r·min-1的水浴恒温振荡器中振荡一定时间，滤出大孔材料，用相同pH值的磷酸盐缓冲溶液洗涤至洗涤液中检测不到蛋白含量为止，25℃下真空干燥，4℃下储存待用，固定化脂肪酶标记为PFL@PDA/SiO2（Scheme 1）。

1.4表征方法

采用AMETEK公司的SU70型扫描电镜(SEM)对大孔SiO2、PDA/SiO2和PFL@PDA/SiO2样品形貌进行表征；用MICROMERITICS INSTRUMENT公司的AutoPore IV9500型压汞仪对大孔SiO2的孔径分布、孔体积和孔隙率进行表征；用北京金埃谱科技有限公司的V-Sorb 2800P型比表面积及孔径分析仪进行比表面积分析，利用BET公式计算大孔SiO2和PDA/SiO2的比表面积；用Nicolet公司PEOTEGE460 E.S.P型傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)，采用KBr压片法测定样品的结构组成，扫描范围为400～4 000 cm-1；用AMETEK公司的EDAX型能谱仪(EDX)随机选取样品不同区域进行元素分析；用Mehler-Toledo公司的TGA/SDTA 851e型热重分析仪，在N2保护下，以10℃·min-1的升温速度在30～600℃范围内测定样品的热分解规律；用北京普析通用公司的T6新世纪紫外-可见分光光度计分别读取595和410 nm处对应的蛋白质和对硝基苯酚的吸光度。

1.5酶活和蛋白含量的测定

以对硝基苯月桂酸酯(p-NPL)为底物测定脂肪酶的活性[21]。取0.1 g固定化脂肪酶（或当量的游离脂肪酶）加入4 mL的p-NPL底物溶液中，在37℃下反应3 min，用分光光度法在波长为410 nm处测定水解产物对硝基苯酚(p-NP)的吸光度，根据标准曲线计算反应生成的p-NP量。一个酶活(U)单位定义为每分钟产生1 μmol p-NP所需的酶量。为便于考察变量对酶固定化条件以及固定化酶性质的影响，以同组实验中酶活的最高值或处理前的酶活为100%进行数据处理。酶活回收率=(固定化脂肪酶的酶活/与固定化脂肪酶等量的游离脂肪酶的酶活)× 100%。根据Bradford法[22]测定脂肪酶溶液在595 nm处的吸光度，以牛血清蛋白为标准绘制标准曲线，计算脂肪酶的固载量。

2　结果与讨论

2.1材料的表征

2.1.1材料的形貌分析

图1为大孔SiO2(A、D)、PDA/SiO2(B、E)和PFL@PDA/SiO2(C、F)的SEM图。由图1(A、D)可以看出大孔SiO2的孔壁为连续的SiO2纳米薄膜、厚度在25～35 nm，大孔孔径在300～500 nm之间，具有三维连续贯通的孔道结构。对比图1(B、E)可知，经PDA修饰后，孔道结构没有明显变化，孔壁厚度有所增加，说明形成了聚多巴胺/二氧化硅复合纳米薄膜构筑的大孔材料。固定化酶后(图1F)，孔壁表面出现了一些酶纳米颗粒，未出现孔道堵塞现象，生物催化剂很好地保持了原有大孔SiO2的孔结构。

图1　大孔SiO2(A,D)、PDA/SiO2(B,E)和PFL@PDA/SiO2(C,F)的SEM图Fig.1　SEM images of macroporous SiO2(A,D),PDA/SiO2(B,E)and PFL@PDA/SiO2(C,F)

2.1.2孔性质及比表面积分析

利用压汞法测得大孔SiO2的孔体积为5.6 cm3· g-1，孔隙率为90%，中值孔径为350 nm、孔径主要分布在300～500 nm之间，与电镜图所观察的结果一致。通过BET方程计算得到大孔SiO2和PDA/SiO2的比表面积分别为46 m2·g-1和36 m2·g-1，PDA修饰后，比表面积有所降低，此结果与文献[23]相似，这可能是由于部分介孔被PDA堵塞的缘故。

2.1.3结构组成表征

大孔SiO2、PDA/SiO2、PFL@PDA/SiO2和游离PFL的红外光谱如图2所示。大孔SiO2谱图(图2a)中，在466 cm-1和808 cm-1为Si-O伸缩振动峰，1 105 cm-1对应Si-O-Si反伸缩振动峰，1 230 cm-1为SiO2表面Si-O-H中O-H的弯曲振动峰,3 440 cm-1处的宽峰为Si-O-H中O-H的伸缩振动峰。PDA/SiO2谱图(图2b)中3 459 cm-1处的特征峰为O-H和N-H伸缩振动峰的叠加，新增的峰1 596 cm-1对应聚多巴胺苯环C=C伸缩振动峰，2 937 cm-1对应CH2的伸缩振动峰[24]，1 358 cm-1对应酚的C-O-H弯曲振动峰，说明聚多巴胺成功修饰到SiO2大孔材料上。游离的脂肪酶(图2c)展示出酰胺基（CONH）的特征吸收峰，1 601 cm-1为酰胺Ⅰ中C=O伸缩振动峰，1 452和1 355 cm-1处为酰胺Ⅱ和Ⅲ的特征吸收峰，在1 100～1 000 cm-1处的吸收峰为肽链中C-C和CN的振动吸收峰[25]。当PFL固定在PDA/SiO2复合材料上后，脂肪酶中酰胺Ⅰ的振动吸收峰与聚多巴胺苯环C=C伸缩振动峰重叠，但酰胺Ⅱ的吸收峰在1 458 cm-1处出现，而且在1 353 cm-1和1 200～900 cm-1处的振动峰显著增强，因此红外振动吸收峰对应的改变说明PFL固定在PDA/SiO2复合材料上。

图2大孔SiO2(a)、PDA/SiO2(b)、PFL@PDA/SiO2(c)和游离PFL(d)的红外光谱图Fig.2　IR spectra of macroporous SiO2,PDA/SiO2(b), PFL@PDA/SiO2(c)and free PFL(d)

图3(a)为SiO2大孔材料的EDX图，显示只含有O、Si两种元素。图3(b)和3(c)为随机选取的PDA/ SiO2表面和内部的EDX图，均检测到C、N、O、Si的元素特征峰，从图中可以看出，PDA/SiO2表面和内部的各元素含量百分比大致相同，说明PDA均匀粘附在SiO2大孔材料孔壁上。

图3　大孔SiO2(a)、PDA/SiO2表面(b)和内部(c)的EDX谱图Fig.3　EDX spectra of macroporous SiO2(a),the surface(b)and the inside(c)of PDA/SiO2

大孔SiO2和PDA/SiO2的热重和差热曲线如图4所示，大孔SiO2脱去表面部分硅羟基大约失重2%，PDA/SiO2在250～420℃之间有明显的失重，保留了近91.6%的质量，PDA/SiO2的失重由PDA分解所引起，去除SiO2大孔材料本身的热失重，得到PDA占PDA/SiO2大孔复合材料质量的约6.4%。

2.2固定化脂肪酶条件的优化

2.2.1初始脂肪酶浓度对固定化的影响

当脂肪酶溶液pH值为8.5、固定化时间为16 h时，酶活和固载量随初始脂肪酶浓度的变化曲线如图5，脂肪酶的酶活随浓度的增加先逐渐增加，当初始酶浓度为0.4 mg·mL-1时，酶活最大；当酶浓度大于0.4 mg·mL-1时，酶活呈减小的趋势，脂肪酶的固载量始终呈现不断增加的趋势。该现象可能是由于载体表面负荷能力一定，随着酶浓度的增加载体结合酶蛋白的总量增加，酶活逐渐增大，然而不断增加初始酶的浓度造成酶分子的拥挤，酶的活性位点被阻塞，阻碍酶与底物之间的反应，表现为固定化酶的活性呈下降趋势[26]。

图4　大孔SiO2和PDA/SiO2的TG-DTG曲线Fig.4　TG and DTG curves of macroporous SiO2andPDA/SiO2

图5　初始酶浓度对脂肪酶固定化的影响Fig.5　Effect of initial concentration on lipaseimmobilization

2.2.2固定化时间的影响

当初始脂肪酶浓度为0.4 mg·mL-1、pH值为8.5时，固定化时间对酶活和固载量的影响如图6，在反应初始阶段，随着固定化时间的延长酶活逐渐增加，当固定化时间达到14 h时，相对酶活达到最大，延长固定化时间，酶活并没有增加，反而有所降低，而固载量在前9 h内基本呈直线上升，至14 h基本达到饱和值，与陶维红等[27]的研究结果相似，选取14 h为固定化时间。

图6　时间对脂肪酶固定化的影响Fig.6　Effect of time on lipase immobilization

2.2.3pH值对脂肪酶固定化的影响

脂肪酶初始浓度为0.4 mg·mL-1、固定化时间为14 h时，溶液pH值对脂肪酶固定化效果的影响如图7所示，pH值在6～9变化时，脂肪酶的固载量并未随着pH值的变化有很大的变化，维持在一定范围内，而固定化脂肪酶的酶活随着pH值的升高呈现先增大后减小的趋势，当pH值为8时固定化脂肪酶的酶活最大。溶液pH值值影响脂肪酶的离子化状态[28]，中性或弱碱性的情况下，固定化脂肪酶酶活明显增强，可能通过pH值的调控，酶的赖氨酸的ε-氨基与组氨酸的咪唑基与载体表面聚多巴胺的作用实现固定化；在pH值小于7.5或者大于8.5的范围，酶活下降，由于酶作为一种蛋白质，溶液pH值超过一定范围时，酶的构象会发生可逆或不可逆的变化，导致酶活的降低或丧失。

图7　pH值对脂肪酶固定化的影响Fig.7　Effect of pH value on lipase immobilization

综上所述，在固定化时间为14 h、pH值为8、初始脂肪酶浓度为0.4 mg·mL-1时，PFL固定化效果最佳，酶活达到4 650 U·g-1，固载量为4.24 mg·g-1，相应游离酶的酶活为445.2 U·mg-1，酶活回收率达246%。酶活回收率高可能有以下原因：(1)部分脂肪酶分子与载体作用后构象发生了变化，活性中心从封闭状态变成开放状态；(2)PDA/SiO2的孔径比酶分子直径大得多，固定化酶在催化底物反应时，底物容易接近酶的活性中心[29]，产物容易从催化剂的孔道内扩散至溶液本体中。

2.3固定化酶的酶学性质

2.3.1最适pH值和温度

测定固定化脂肪酶和游离脂肪酶在不同pH值下的酶活，相对酶活随pH值的变化如图8所示。游离脂肪酶的最适pH值为8，固定化脂肪酶的最适pH值为9，固定化脂肪酶比游离酶展现了更宽的pH值适应范围，在pH值为7到10范围内固定化脂肪酶受pH值的影响较小，相对酶活在90%以上，这与Lei等[30]的报道类似，可能与固定化方法和载体的结构有关。

图8　pH值对游离脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影响Fig.8　Effect of pH value on the activities of immobilized and free lipase

测定固定化脂肪酶和游离脂肪酶在不同温度下的酶活，相对酶活随温度的变化如图9所示。游离脂肪酶和固定化脂肪酶的最适温度均为40℃，但固定化脂肪酶在20～60℃温度范围内酶活维持在80%以上，显示出更宽的温度适应范围，在相同温度下游离脂肪酶比固定化脂肪酶的酶活降低的程度大，表明固定化脂肪酶有较好的温度适应性。

图9　温度对游离脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影响Fig.9　Effect of temperature on the activities of immobilized and free lipase

2.3.2热稳定性

Park等[31]研究PFL的热稳定性时发现：在磷酸盐缓冲溶液中，当温度高于50℃时，PFL热失活很快。为了更好地对比固定化脂肪酶和游离脂肪酶的热稳定性，分别将它们置于50℃下磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1,pH值7.0）中保温，每隔30 min在相同的条件下测定酶活。如图10所示，相较游离脂肪酶，固定化脂肪酶的酶活降低的幅度很小，保温480 min后游离脂肪酶的相对酶活降到8.2%，而固定化脂肪酶的相对酶活为70%，固定化脂肪酶的热稳定性远远优于游离脂肪酶的热稳定性，实验结果与Lei等[32]用磁性微球为载体固定褶皱假丝酵母脂肪酶的热稳定性测试结果相似，这归因于在脂肪酶固定化后刚性有所提高，降低了高温条件下引起酶失活的速度。

图10　游离脂肪酶和固定化脂肪酶的热稳定性Fig.10　Thermal stabilities of immobilized and free lipase

2.3.3操作稳定性和储存稳定性

固定化脂肪酶与底物重复反应8批次的结果如图11所示，重复使用5批次后，相对酶活降为68%，酶活损失相对较快，可能是由于在重复使用或清洗过程中部分以物理吸附方式吸附于载体上的酶分子脱落造成酶活损失。重复操作6批次之后，相对酶活保持在50%不再变化，说明另一部分酶分子与PDA/SiO2载体形成了稳定的共价键，不容易脱落。脂肪酶经固定化后具有较好的稳定性和重复使用性。

将固定化脂肪酶和游离脂肪酶储存在4℃条件下，每隔一定时间测定酶活，储存稳定性如图12所示。固定化酶储存20 d后相对酶活为89.3%，而游离酶的为62.3%，游离酶在储存58 d后，相对酶活仅剩11.5%，而固定化酶的相对酶活仍然保持在66%，说明PFL被固定化后储存稳定性显著提高，优于PFL固定于氨基功能化修饰的Fe3O4纳米颗粒的储存稳定性（储存21 d后相对酶活为40%）[33]。

图11　固定化脂肪酶的操作稳定性Fig.11　Operational stability of immobilized lipase

图12　固定化脂肪酶的储存稳定性Fig.12　Storage stability of immobilized lipase

2.4动力学常数

动力学常数Km是酶的特征常数，是衡量酶与底物之间亲和力大小的依据,越低的Km值意味着酶与底物有更好的亲和性。配制浓度不同的p-NPL底物溶液，将固定化脂肪酶和游离脂肪酶分别与底物反应3 min后，测定410 nm处的吸光度变化值，根据对硝基苯酚的浓度-吸光度标准曲线，计算反应的初始速度(V)，以1/V和1/S（S为底物浓度）为坐标作Lineweaver-Burk双倒数图（如图13）。通过计算求得固定化脂肪酶的Km值为1.783 mmol·L-1，游离脂肪酶的Km为2.298 mmol·L-1，固定化脂肪酶的Km略低于游离脂肪酶的Km，反映了脂肪酶固定化后与底物有较好的亲和性。

图13　脂肪酶的Lineweaver-Burk双倒数图Fig.13　Lineweaver-Burk plots of immobilized and free lipase

3　结论

以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制得大孔SiO2，其具有三维连续贯通的大孔孔道结构，孔径分布在300～500 nm，比表面积大，孔隙率高。采用原位聚合法，使聚多巴胺均匀地粘附在大孔SiO2的孔壁上制得复合纳米薄膜构筑的PDA/SiO2大孔材料，它很好地保持了大孔SiO2的孔道结构。以PDA/ SiO2为载体固定化荧光假单胞菌脂肪酶，酶活回收率达246%，与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶的热稳定性、储存稳定性等酶学性质均显著提高。大孔PDA/SiO2既具有无机材料机械强度高、化学和热稳定性好等特点又结合了高分子涂层表面富含功能基团等优点；同时，三维连续贯通的大孔能够较好地解决传质问题，固定化酶能得到高效利用；而且大尺寸的块状材料便于回收利用。因此，用PDA/SiO2固定化酶有良好的应用前景。

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Immobilization of Pseudomonas Fluorescens Lipase on PDA/SiO2Macroporous Composite

BAI Wen-Jing LI Yun CAO Da-Li WU Yan-Fei LIANG Yun-Xiao＊
(State Key Laboratory Base of Novel Functional Materials and Preparation Science,Faculty of Materials Science and Chemical Engineering,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang 315211,China)

A large-sized macroporous SiO2was prepared via a polymer template with three-dimensional(3D) skeletal structure and it was surface functionalized with polydopamine(PDA)by controlling the in situ polymerization of dopamine in its micro-channels to obtain the macroporous composite polydopamine/SiO2(PDA/SiO2). Samples were characterized by SEM,EDX,MIP,BET,TG-DTA and FTIR.PDA/SiO2was used to immobilize pseudomonas fluorescens lipase(PFL),immobilization conditions were optimized,and the properties of immobilized and free PFL were studied.The results show that the macroporous SiO2has 3D continuous pass-through pore structure,the pore sizes are in the range of 300～500 nm.After modification with PDA,the pore walls of the resulting PDA/SiO2are composed of PDA and SiO2composite nano-film.The best activity recovery of immobilized lipase is 246%under conditions of immobilizing time of 14 h,pH of 8 and initial PFL concentration 0.4 mg· mL-1.Compared with free PFL,the optimum working temperature and pH ranges of immobilized PFL are both widened,and the thermal stability of immobilized PFL is improved significantly.Immobilized PFL has good operational and storage stabilities.The Kmof immobilized PFL is lower than that of free PFL,suggesting a better affinity capacity between PFL and substrate.

macroporous SiO2;functionalization;polydopamine;immobilization;pseudomonas fluorescens lipase

Q814.2

A

1001-4861(2016)11-1973-08

10.11862/CJIC.2016.261

2016-05-19。收修改稿日期：2016-10-07。

浙江省公益项目(No.2014C31130)、浙江省自然科学基金(No.LY12B01004)和宁波大学王宽诚幸福基金(No.XKL072)资助。＊通信联系人。E-mail：liangyunxiao@nbu.edu.cn；会员登记号：S060017726M。