天麻素注射液对帕金森病大鼠的保护作用

席 晅 任小琼

(甘肃医学院基础教学部生理学教研室，甘肃 平凉 744000)



天麻素注射液对帕金森病大鼠的保护作用

席 晅 任小琼1

(甘肃医学院基础教学部生理学教研室，甘肃 平凉 744000)

目的 观察天麻素注射液对帕金森病(PD)大鼠的保护效应及探讨其部分机制。方法 将60只大鼠随机分为假手术组、天麻组及模型组，各20只。其中天麻组及模型组接受纹状体内多位点注射6-羟基多巴胺(OHDA)以建立PD模型，造模成功后模型组接受0.2 g·kg-1·d-1生理盐水肌肉注射，天麻组接受0.2 g·kg-1·d-1天麻素注射液肌肉注射，持续干预14 d直至处死。比较各组干预前后行为学变化，纹状体组织中 Bcl-2、Bax 蛋白及mRNA的表达变化。结果 ①接受PD模型造模后的大鼠旋转次数明显较假手术组增多(P<0.05)，经过天麻素注射液治疗后大鼠旋转次数明显减少(P<0.05)。②接受造模的大鼠纹状体内Bcl-2蛋白/mRNA水平低于假手术组，Bax蛋白/mRNA水平显著高于假手术组(P<0.01)，经过干预后天麻素组纹状体内Bcl-2蛋白/mRNA水平较模型组明显升高(P<0.05)，Bax蛋白/mRNA水平明显下降(P<0.05)。结论 天麻素可明显改善PD模型大鼠的临床症状，其机制可能与通过升高纹状体Bcl-2降低Bax含量有关。

帕金森病；天麻素注射液；Bcl-2；Bax

帕金森病(PD)发病原因目前尚未有统一的定论，以静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓为主要临床表现，以黑质纹状体多巴胺(DA)神经元渐进性数量减少或者变性为病理改变〔1〕。目前针对PD的发病机制有学者提出“凋亡”假说，他们认为PD疾病发展的最终阶段均表现为DA能神经元细胞的凋亡〔2〕。Bcl-2及Bax两个因子广泛参与调控神经元细胞的凋亡过程。目前治疗方法虽可以发挥一定的治疗作用，但仍无法阻止DA神经系统的进一步紊乱。现代药理学研究证实天麻素具有清除自由基、保护神经元等作用，日本早已将天麻素运用于各类肢体震颤的治疗中。本研究通过检测PD大鼠纹状体Bcl-2及Bax因子的表达变化，以探讨天麻素治疗PD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康成年 SD大鼠，清洁级，60只，平均体质量(275±25)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号码：SCXX(沪)2007-0005)。SPF级医学实验动物饲养环境，温度(22±2)℃，相对湿度(60±10)%，定时通风换气，模拟标准昼夜系统即12 h光照+12 h黑夜，可提供实验动物在该恒温恒湿环境中适应性喂养1 w，给予自由饮食和饮水。随机分为假手术组、天麻组和模型组各20只。

1.2 主要试剂及仪器 Bc1-2、Bax、β-actin 一抗、碱性磷酸酶标记山羊抗兔(CST 公司，美国)；预染蛋白彩虹 Marker(Promega 公司，美国)；Trizol(Invitrogen 公司，美国)；二氨基联苯胺(DAB)免疫组化试剂盒(ZYMH 公司，美国)，PCR 引物(生工生物工程有限公司，上海)，大鼠颅钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，6-羟基多巴(美国Sigma 公司产品)。

1.3 模型制备 室温 22℃ 条件下，大鼠称重后，以 3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛进行完全麻醉后固定于脑立体定位仪上，前囟部位充分消毒后备皮，根据《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧纹状体坐标，以微量进样器头分别于两个注射点进行6-OHDA溶液注射：①正中线左旁开3 mm，于前囟平行处，硬膜下5.5 mm；②正中线左旁开3 mm，于前囟嘴侧0.7 mm，硬膜下4.5 mm。药物剂量3 μg/μl，注射速度1 μl/min。注射完毕后缓慢退出微量进样器针头，缝合皮肤，碘伏局部消毒。造模成功后模型组接受0.2 g·kg-1·d-1生理盐水肌肉注射，天麻组接受0.2 g·kg-1·d-1麻素注射液肌肉注射。比较各组干预前后行为学变化，纹状体组织中Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表达变化。假手术组用等量生理盐水替代6-OHDA，操作方法同上。

1.4 Western印迹法检测相关因子蛋白的表达 取各组纹状体组织50 mg 剪碎，用匀浆器匀浆后置于冰上，加入 0.25 ml 含蛋白酶抑制剂(PMSF)裂解缓冲液后再进行研磨至完全裂解后充分混匀，14 000 r/min，4℃，离心5 min，取上清液100 μl，EP 管分装后备用。将样本依次逐渐上样至事先将配制好的 SDS-PAGE 胶中，先用 80 V的电压跑浓缩胶，当样品跑至分离胶时则改用100 V电压，待溴酸蓝跑至胶底部即可停止电泳，再经过转膜、封闭孵育后分别加入按照1∶1 000稀释的Bc1-2、Bax一抗。4℃ 摇床孵育过夜后以洗涤缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min。再按说明书加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温，摇床孵育2 h。二抗孵育完成后，将PVDF膜取出用TBST清洗3次，每次10 min，最后再将用TBST浸洗15 min。将PVDF取出，用滤纸吸去液体，置于平铺保鲜膜的工作台上，加入电化学发光(ECL)试剂(A液与B液等体积混合)，放入暗室中，静置反应1 min。运行Bio-Rad Image软件生物图像分析处理。

1.5 RT-PCR技术检测相关因子mRNA的表达 将各组纹状体组织50 mg移至1.5 ml EP管中加入0.25 ml Trizol研磨，再加入300 ml Trizol吹打均匀，加入0.2 ml氯仿，将管盖闭合后剧烈震荡15 s后室温静置3 min。在低温离心机上4℃，转速12 000 r/min，离心15 min，轻轻将上层水相移至新EP管中，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解RNA，根据RNA浓度计算上样量，逆转录成cDNA，在如下体系扩增：预变性95℃，3 min；变性95℃，30 s→退火55℃～60℃，30 s→延伸72℃，30 s；从变性至延伸持续35个循环；终止延伸72℃，10 min。DNA Marker 及各组待测样本各取5 μl上样，用0.5×Tris硼酸(TBE)溶液作为电泳液，电压90～100 V，电泳30 min。④所得DNA条带用Model Gel 2 000凝胶成像分析仪进行成像。以β-actin作为内部参照，用Bio-Image图像分析系统统计数据。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及协方差分析。

2 结 果

2.1 行为学变化 造模后各组颈部皮下注射阿朴吗啡(APO)，注射1～5 min后大鼠开始出现以健侧后肢为支点的旋转，顺时针方向，首尾相接。假手术组注射后并未出现旋转行为，而模型组均出现旋转行为；模型组(15.61±2.62)和天麻组(14.5±2.96)干预前旋转圈数无统计学差异(P>0.05)，经过治疗后天麻组旋转圈数(5.51±2.72)较模型组(14.45±2.55)明显下降(P<0.05)。

2.2 各组Bcl-2及Bax mRNA的表达 各组内参GAPDH mRNA扩增条带亮度强弱相似。以与GAPDH同比例的模板量加入，各组Bcl-2 mRNA与Bax mRNA RT-PCR的扩增条带亮度具有明显差异，与假手术组比较，Bcl-2 mRNA扩增条带亮度显著减弱，Bax mRNA扩增条带亮度明显增强(P<0.05)，其中模型组与天麻组差异无统计学意义(P>0.05)。干预后，与模型组比较，天麻组纹状体Bcl-2 mRNA扩增条带亮度明显增强，Bax mRNA扩增条带亮度明显减弱(P<0.05)。见表1。

2.3 各组Bcl-2及Bax蛋白的表达 与假手术组比较，模型组及天麻组纹状体Bcl-2明显降低，Bax明显升高(P<0.05)。干预前模型组与天麻组差异无统计学意义(P>0.05)。干预后，与模型组比较，天麻组纹状体Bcl-2表达明显增加，Bax水平明显下降(P<0.05)，见表1、图1。

表1 各组Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表达

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.01

图1 3组Western印迹结果比较

3 讨 论

APO诱发PD模型大鼠的旋转行为是目前被视为较客观的评价手段〔3～5〕，APO属于DAD2受体激动剂，DAD2受体多存在于DA能神经元突出后膜，DA能神经元数量减少是PD的主要病理改变之一，有研究表明当灰质纹状体DAD2受体减少超过70%时动物会出现动作僵硬迟缓等症状。随着APO注射后，DAD2受体数量增多，导致大鼠出现去神经超敏现象，从而出现APO诱导的旋转行为。天麻素是天麻的有效成分，具有明显的镇静、抗惊厥效应。现代药理学证实天麻素可明显扩张椎基底动脉系统，从而增加脑血流量，发挥保护脑神经、促进心肌细胞能量代谢的作用〔6～8〕。Bcl-2和Bax是目前较为公认的处于动态平衡的调控基因组，其中Bcl-2可抑制细胞的凋亡，Bax可诱导细胞凋亡，因此Bcl-2和Bax的表达量是抑制/诱发细胞凋亡的重要因素〔9〕。天麻注射液可调节Bcl-2家族成员的活性，抑制细胞凋亡蛋白 Bcl-2 发挥抗凋亡作用，还可以使促进细胞凋亡蛋白 Bax 磷酸化而失活，从而抑制细胞凋亡。推测，天麻素抗DA能神经元细胞凋亡很可能是其对PD动物模型保护作用的主要机制之一，天麻素如何实现其抗凋亡值得研究。

1 中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组.中国帕金森病治疗指南(第 2 版)〔J〕.中华神经科杂志，2009；42(5)：352-5.

2 Iance R，Mohapel P，Brundin P，etal.Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkionson′s disease in mice〔J〕.Behav Brain Res，2005；162(1)：1-10.

3 Macinnes N，Duty S.Locomotor effects of imidazoline 12-site-specific ligands and monoamine oxidase inhibitors in rats with a unilateral 6-OHDA lesion of the nigrostriatal pathway〔J〕.J Br Pharmacol，2004；143(8)：952-9.

4 Sgambato-Faura V，Buggia V，Gilbert F，etal.Coordinated and spatial upregulation of arc in striatonigral neurons correlates with L-dopa-induced behavioral sensitization in dyskinetic rats〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2005；64(11)：936-47.

5 Soldner F，Hockemeyer D，Beard C，et a1.Parkinson′s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors〔J〕.Cell，2009；136(5)：964-77.

6 Tsuboi Y.Environmental-genetic interactions in the pathogenesis of Parkinson′S disease〔J〕.Exp Neurobiol，2012，21(3)：123-8.

7 吕国平，王春芹.天麻素注射液的药理及临床研究〔J〕.中草药，2002;33(5)：附3-5.

8 杨万兴，吕金胜，封永勇，等.天麻醇提液对动物急性炎症的影响〔J〕.药物研究，2002;11(12)：26.

9 Blesa J，Phani S，Jackson-Lewis V,etal.Classic and new animal models of Parkinson′s disease〔J〕.J Biomed Biotechnol，2012;2012:e845618.

〔2015-01-19修回〕

(编辑 苑云杰)

席 晅(1966-)，男，副教授，主要从事生理学研究。

R965.1

A

1005-9202(2016)20-4996-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.023

1 甘肃医学院第一附属医院肿瘤内科