马铃薯块茎蛋白质提取方法的筛选

唐世明+曹君迈+陈彦云+马玉龙

摘要：以青薯168、克新1号的芽眼部、侧部及髓部为试验材料，分别采用丙酮提取法、三氯乙酸（TCA）提取法、盐提取法、醇提取法、酚提取法提取，并用分光光度法对不同部位的蛋白质含量进行测定。采用2因素随机区组设计，研究品种、提取方法、取样部位以及不同因素组合对蛋白质含量的影响。结果表明：不同品种的蛋白质含量不同，青薯168显著高于克新1号（P<0.05），达128.0 mg/L；不同提取方法之间蛋白含量不同，丙酮提取法、盐提取法和TCA提取法的蛋白含量间无显著差异，但显著高于酚提取法、醇提取法（P<0.05），前3种提取方法的蛋白质含量为153.3～159.7 mg/L；马铃薯块茎芽眼部的蛋白质含量显著高于侧部及髓部（P<0.05），达140.7 mg/L；品种、提取方法、取样部位不同组合间差异显著（P<0.05）。综合比较可知，适合青薯168芽眼部的提取方法为盐提取法，适合克新1号芽眼部的提取方法为TCA提取法。

关键词：马铃薯块茎；品种；提取方法；部位；蛋白质含量

中图分类号： TS201.2+1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0326-03

马铃薯是多年生草本，可作一年生或一年两季栽培作物，既可粮菜兼用，又可制成生物燃料及饲料，还具有和胃、调中、健脾、益气的作用，对胃溃疡、习惯性便秘、胶原病、热咳及皮肤湿疹也有治疗功效。同时，马铃薯也是一种营养保健食品。马铃薯资源非常丰富，而且己有报道表明，马铃薯蛋白粉的营养价值明显优于豆粕[1]，是优质的天然氮源，具有广阔的发展前景[2]。马铃薯蛋白能很好地被人体所吸收，属于完全蛋白质[3-4]，其蛋白效价可以与鸡蛋、酪蛋白相媲美，营养价值优于从谷物或豆类中提取的蛋白质[5]。马铃薯蛋白最接近动物蛋白，是很好的保健食品[6-7]，其蛋白质的净消化利用率也很高[8]，马铃薯的蛋白可利用价值为71%，比谷物高21%。马铃薯中的必需氨基酸含量高于大多数粮食作物，富含赖氨酸、色氨酸，是一般粮食所不能比的。与大米和面粉相比，马铃薯具有更多的优点，可以堪称“十全十美的食物”[9]。近年来，马铃薯块茎蛋白质组学的研究有助于我们了解块茎生长和发育机理，也有助于马铃薯块茎产量及品质等性状的提高[10]。因此，开展马铃薯蛋白质提取方法的研究对开展其他研究工作具有重要意义。

国内外关于马铃薯块茎蛋白质提取方法的报道较少，李萌萌等开展了马铃薯块茎蛋白质提取方法的研究[11-12]。而由于马铃薯不同品种的蛋白质含量存在很大差异，且受到环境温度、薯块成熟度及薯块上不同部位的影响，其结果也不同，不同的材料需要采用适合其特性的部位进行蛋白质的提取[11]。针对这些问题，本试验选用不同品种马铃薯的不同部位进行不同提取方法的筛选，以期为马铃薯蛋白质提取及其进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用马铃薯品种为克新1号（Kexin 1）、青薯168（Qingshu168），由宁夏固原天启薯业有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验1采用2因素随机区组试验设计，因素1为品种（V），V1为克新1号（Kexin 1）、V2为青薯168（Qingshu 168）；因素2为提取方法（T），分5个水平，T1为丙酮提取法，T2为盐提取法，T3为三氯乙酸（TCA）提取法，T4为酚提取法，T5为醇提取法。试验重复3次，共10个处理。

试验2采用2因素随机区组试验设计，因素1为提取方法（T），分5个水平：T1～T5；因素2为取样部位（P），分为3种处理：P1为芽眼部，P2为侧部，P3为髓部。试验重复3次，共15个处理。

试验3采用2因素随机区组设计，因素1为品种（V），含V1、V2；因素2为取样部位（P），分为3种处理：P1、P2、P3。试验重复3次，共6个处理。

1.2.2 马铃薯蛋白质的提取部位 芽眼部：芽眼在块茎上呈螺旋状排列，顶端密，基部稀，提取时绕芽眼周边约0.7 cm、深度约0.6 cm提取。侧部：即维管束环，从皮层往内0.6 cm左右的厚度。髓部：块茎中央部位，在块茎的横切面上，可以明显地看出块茎中央为髓部，外面围绕着开放维管束环。

1.2.3 马铃薯蛋白质的提取方法 TCA提取法、丙酮提取法采用王改萍等的方法[13]。酚提取法、盐提取法及醇提取法分别采用Hurkman等报道的方法[14-16]。

1.2.4 样品中蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定采用郭蔼光等介绍的方法[17]进行。用牛血清蛋白（BSA）作标准曲线，测定595 nm处的吸光度。用绘图软件，以蛋白浓度为纵坐标（y）、D595 nm为横坐标（x）作标准曲线，详见图1。

1.2.5 统计分析 试验所得数据采用Excel 2003处理后，用SPSS 17.0软件进行2因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 品种对马铃薯蛋白质含量的影响

由表1可知，不同品种之间蛋白质含量不同，青薯168显著高于克新1号。

2.2 提取方法对马铃薯蛋白质含量的影响

由表2可知，不同提取方法对蛋白质含量均有影响，TCA法、丙酮提取法、盐提取法之间无显著差异，但显著高于酚提取法和醇提取法，后二者之间无显著差异。

2.3 不同部位对马铃薯蛋白质含量的影响

由表3可知，不同取样部位对蛋白质含量均有影响。芽眼部位蛋白质含量显著高于髓部和侧部，但后二者之间无显著差异。

2.4 品种和提取方法对马铃薯块茎蛋白质含量的影响

由表4可知，克新1号品种以TCA提取法为佳，青薯168品种以盐提取法为佳，均以丙酮提取法次之。酚提取法、醇提取法提取的蛋白质含量最低。

2.5 提取方法和取样部位对马铃薯块茎蛋白质含量的影响

由表5可知，适合芽眼的提取方法有TCA提取法、盐提取法，其次为丙酮提取法；适合侧部的提取方法有盐提取法、丙酮提取法，其次为TCA提取法；适合髓部的提取方法有丙酮提取法，其次为TCA提取法和盐提取法；适合3个部位提取的最差方法为酚提取法、醇提取法。

2.6 品种和取样部位对马铃薯块茎蛋白质含量的影响

由表6可见，不同马铃薯取样部位、不同品种的蛋白质含量表现出一定的规律。马铃薯块茎不同部位、品种间的蛋白质含量差异基本达显著水平。青薯168、克新1号均以芽眼部位含量最高，髓部最低。因此，这2个品种取样的最佳部位均为芽眼。

3 讨论

本试验以青薯168、克新1号的芽眼部、侧部及髓部为试验材料，分别采用丙酮提取法、TCA提取法、盐提取法、醇提取法、酚提取法提取蛋白质。结果表明，不同品种之间蛋白质含量不同，青薯168显著高于克新1号；不同提取方法之间蛋白含量不同，丙酮提取法、盐提取法与TCA法提取的蛋白含量无显著差异，但显著高于酚提取法、醇提取法，而后二者无显著差异；不同取样部位对蛋白质含量均有影响，芽眼部位蛋白质含量显著高于髓部、侧部，但后二者之间无显著差异；克新1号品种以TCA提取法为佳，青薯168品种以盐提取法为佳，均以丙酮提取法次之，酚提取法、醇提取法提取的蛋白质含量最低。可见，适合芽眼的提取方法有TCA提取法、盐提取法，其次为丙酮提取法；适合侧部的提取方法有盐提取法、

丙酮提取法，其次为TCA提取法；适合髓部的提取方法有丙酮提取法，其次为盐提取法和TCA提取法。综合试验的可操作性，建议马铃薯蛋白质采用丙酮提取法。

李萌萌等使用5种方法从马铃薯中薯9号块茎中提取蛋白质，并用Bradford法测定其中蛋白质的含量，结果显示：磷酸缓冲液提取法的粗蛋白含量最高，为105.3 mg/L，其次是直接提取方法，为72.3 mg/L，提取蛋白质最少的是酚提取法，为10.3 mg/L；蛋白质纯度最好的提取方法是TCA法，纯度可达10.92%；其次是直接提取法，为7.66%；酚提取法最低，仅为1.32%[11]。以上结果综合表明，直接提取法效果最好。范吉星等以红海榄根为材料，比较丙酮沉淀法、TCA法、酚法等几种方法，认为上述方法均不甚理想，蛋白提取的纯度较低，也无法呈现清晰的条带，而经过改良的酚法则得到了很好的效果[18]。谷瑞升等以木本植物为材料，比较丙酮沉降法、TCA法和直接提取法等方法，认为丙酮沉降法最优，建议马铃薯蛋白质提取采用丙酮提取法[19]。

在本试验中，醇提取法、酚提取法效果均较差，蛋白质损失量较高。而应用丙酮提取法、盐提取法、TCA提取法所得结果均比醇、酚提取法好，表明对于马铃薯块茎来说，丙酮提取法、盐提取法、TCA提取法可能是较适合的方法。但这些方法的不足之处是蛋白液中含有相对较多的杂质，有可能对进一步的深入研究带来干扰。因此需要进一步探索更适合、更简便、更高效尤其是纯度更高的马铃薯块茎蛋白质的分离纯化方法，为利用和深入研究马铃薯块茎蛋白质提供依据。

有研究表明，料液比为1 g ∶10 mL、浸泡温度为35 ℃、pH值为9.8、浸泡时间为1h时，盐提取法提取马铃薯蛋白质的得率最大，达0.80 g/100 g[15]。本试验的盐提取法的条件大致相同，最终提取到的蛋白质含量为159.67 mg/L。

TCA沉淀法、丙酮沉淀提取法是进行蛋白质组学分析中最常见的提取方法，这2种方法虽然操作步骤少、耗时短、提取过程中损失较少、简便易行，具有广泛的适用性，在微生物材料以及动植物组织中具有很好的分离效果。但是沉淀所得提取物里含有大量的蛋白质粗提物和杂质，还需要除去杂质并且需要强力的裂解缓冲液及机械辅助，才能提取到较纯的蛋白质。醇提取法在加2-氯乙醇提取之前通过加入氯化钠除去盐溶性蛋白，所以总体提取的蛋白含量很少，但是马铃薯醇提取蛋白仅适用于电泳分析技术。

酚提取法虽然提取的蛋白质含量低，但却是一种非常适合植物材料尤其是难提取材料的蛋白质提取方法。植物细胞由于细胞壁和众多胞内次生代谢物质的存在，给蛋白质提取、纯化带来了很大的难度。酚提法与TCA提取法、丙酮提取法的直接沉淀相比，避免了大量组织残渣、水溶性杂质的污染，也能除去盐离子。在样品制备过程中，核酸、盐、酚、色素和多糖等可溶性物质进入水相，蛋白质和脂类则进入酚相，从而得到了分离。酚层中的蛋白质可通过沉淀进一步纯化并除去盐。该方法所得杂质较少，很适合用于进行电泳试验。TCA沉淀法虽然能够很好地去除蛋白样品中的盐离子，但是对色素、多糖等杂质的去除效果并不是很明显，而且蛋白质经过多次沉淀后溶解是比较困难的，这样会有很多蛋白质损失。首先在样品中加入聚乙烯吡咯烷酮吸附剂，这样可以减少植物中的酚类、醌类和色素等次生代谢物质的干扰；其次，酚可以有效去除样品中的可溶性杂质，也能除去盐离子[20]。另外，由于酚的脂溶性，酚提取法非常有利于膜蛋白的提取，而膜蛋白往往与植物的耐盐性密切相关[21]。因此，酚改良法是一种有效提取红海榄根部蛋白的方法。

盐提取法提取的蛋白质含量虽高，但是相对于别的方法盐提取法操作复杂，需要控制好pH值、温度、料液比和提取时间等因素，同时透析袋的使用也不方便。当样品溶液中的盐离子浓度超过100 mmol/L时，样品的电内渗比较高[22]，而且等电聚焦电压也上不去，这会严重影响等电聚焦的进行，因此可以认为，盐是双向电泳最常见的一种杂质。

4 结论

由本研究可以得出以下结论。（1）不同品种之间蛋白质含量不同，青薯168显著高于克新1号。（2）不同提取方法之间蛋白含量不同，丙酮提取法、盐提取法和TCA法提取的蛋白含量无显著差异，但显著高于酚提取法、醇提取法，而后二者无显著差异。（3）不同取样部位对蛋白质含量均有影响。芽眼部位蛋白质含量显著高于髓部和侧部，但后二者之间无显著差异。（4）2个品种有利于蛋白提取的组合，V1品种以V1T3为佳，V2品种以V1T2为佳。2个品种均为丙酮提取法较佳，最差为酚提取法、醇提取法，因此淘汰后2种方法。（5）适合芽眼的提取方法有TCA提取法、盐提取法，其次为丙酮提取法；适合侧部的提取方法有TCA提取法、丙酮提取法，其次为盐提取法；适合髓部的提取方法有盐提取法，其次为丙酮提取法、TCA提取法；3个部位最差为酚提取法、醇提取法，故淘汰后2种方法。（6）为了试验操作方便，建议马铃薯蛋白质提取采用丙酮提取法。

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