山核桃壳中黄酮提取及其抗氧化活性测定

沙迪+姜芝伊+徐红艳

摘要：以生产山核桃仁产生的废弃物山核桃壳为原料，采用超声波辅助提取法得到粗提液，经大孔树脂柱层析，采用30%、50%、70%乙醇梯度洗脱，将洗脱物真空冷冻干燥，研究洗脱物黄酮纯度和抗氧化物质对ABTS自由基、DPPH自由基、羟自由基的清除能力及还原铁离子的能力。结果表明，黄酮纯度高低依次为：30%洗脱物>50%洗脱物>粗提物>70%洗脱物；清除ABTS自由基的能力大小依次为：维生素C> 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物；清除DPPH自由基的能力大小依次为：维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物>BHT；清除羟自由基的能力大小依次为：维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物；还原铁离子能力大小依次为：维生素C>BHT>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物。30%洗脱物抗氧化性最强，与黄酮纯度呈正相关。

关键词：山核桃壳；大孔树脂；梯度洗脱；抗氧化；黄酮

中图分类号：TS225.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0319-04

山核桃（Juglans mandshurica Maxim.）别称核桃楸、胡桃楸，是胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）落叶乔木，与水曲柳、黄菠萝并称“东北三大硬阔”，是国家Ⅱ级珍稀树种和中国珍稀濒危树种三级保护植物[1]。山核桃树材质坚硬致密，弹性好，是优良的军用细木工和家具用材；果仁营养丰富，树皮、根、叶均可入药[2-4]。山核桃属野生坚果类，富含蛋白质、不饱和脂肪、矿物质、维生素，具有润肺、强肾、降低血脂、预防冠心病等功能，长期食用能够益寿养颜、抗衰老，对智力发育有很好的帮助[5]。近年来，随着人们对健康的关注，山核桃果仁市场需求量不断增加，而在果仁加工过程中产生的大量山核桃壳往往被作为废弃物[6]。但是，有研究显示，山核桃壳中含有大量的活性成分[7]，将这些活性成分开发利用，有利于提高山核桃的附加值。

黄酮是存在于植物体中的一种多酚类物质[8]，是植物长期自然选择过程中产生的次级代谢产物[9]。黄酮是一种很强的抗氧化剂[10-13]，具有较强的清除自由基作用，能够阻止活性氧引起的生物大分子损伤，且对自由基诱发的生物大分子损伤起保护作用[14-15]。研究显示，黄酮还具有阻止细胞退化、延缓衰老、降血压、降血糖、降血脂、提高机体免疫力及减轻癌症发生等作用[16-17]，在心脑血管疾病及癌症的治疗中得到广泛应用[18-19]。本研究以长白山山核桃壳为原料，采用超声波辅助提取粗提物，经大孔树脂柱层析，得到梯度洗脱物；采用分光光度法，测定洗脱物的黄酮纯度，并检测洗脱物对ABTS、DPPH、羟自由基的清除能力及还原铁离子能力，筛选出提取长白山山核桃壳抗氧化物黄酮的方法，为山核桃壳的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山山核桃，采摘于吉林省延边朝鲜族自治州和龙市南岗林区；ABTS、DPPH，Sigma公司产品；芸香苷，中国药品生物制品检定所生产；维生素C，国药集团化学试剂有限公司生产；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、过硫酸钾、FeSO4·7H2O、30%过氧化氢溶液、水杨酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1104型分析天平，上海天平仪器厂生产；U-3900型紫外可见分光光度计，日本日立公司生产；离心机，中国上海生产；N-1001旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司生产；KQ-500DE型医用数控超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程 山核桃壳→粉碎→过筛→乙醇浸泡→超声波辅助提取→抽滤→减压浓缩→大孔树脂梯度洗脱→真空冷冻干燥→纯度分析→测抗氧化活性。

1.3.2 大孔树脂预处理 采用酸碱法[20]。用体积分数为95%的乙醇浸泡，使其充分溶胀24 h，湿法装柱；用2 BV 95%乙醇流动洗脱，至乙醇流出液与蒸馏水1 ∶5混合、不呈现白色浑浊并无有机溶剂异味为止；用蒸馏水将乙醇洗净；用酸碱法对大孔树脂进行处理，用2 BV 5%盐酸溶液缓慢通过树脂层，并浸泡3 h，用大量蒸馏水洗至pH值为中性；用2 BV 5%氢氧化钠溶液缓慢通过树脂层，并浸泡3 h，用蒸馏水洗至流出液pH值为中性。将树脂浸泡于水中，备用。

1.3.3 样品的提取 山核桃壳粉末与60%乙醇混合，250 W、50 ℃超声50 min，抽滤，粗提液50 ℃减压浓缩，得到粗提浓缩液；将粗提浓缩液上大孔树脂柱，蒸馏水除杂质，用30%、50%、70%乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱物；减压浓缩，真空冷冻干燥，得到纯化产品的冻干粉。

1.3.4 芸香苷标准曲线的绘制 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[6]。精确称取芸香苷标准品20 mg，用60%乙醇溶解并在100 mL 容量瓶中定容，摇匀，静置；分别向7支试管中加0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL芸香苷溶液，再加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min；加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；加入5 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀；加入60%乙醇定容至10 mL，静置25 min；用分光光度法测量溶液在波长509 nm处的吸光度，以芸香苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 黄酮纯度的测定 称取适量冻干粉溶于60%乙醇溶液中，按芸香苷标准曲线方法测定黄酮的浓度，获得黄酮纯度，计算公式为：黄酮纯度=V×N×C/m×100%。式中，V表示溶液体积，单位为mL；N表示稀释倍数；C为根据标准曲线计算的浓度；m表示冻干粉质量，单位为mg。

1.3.6 山核桃壳梯度洗脱物的抗氧化活性测定

1.3.6.1 清除ABTS自由基能力 参照程超等的方法[21]，将50 mL 2.6 mmol/L过硫酸钾溶液和7.4 mmol/L ABTS溶液混合，室温避光24 h，制备成ABTS储备液，4 ℃避光储存，备用；现用现稀释，使储备液在波长为734 nm处的吸光度为0.700±0.020，即为ABTS工作液；取ABTS工作液3.80 mL，加入不同浓度的洗脱物样液或维生素C、BHT溶液 0.20 mL，室温避光放置10 min，于734 nm处测定吸光度，计算清除率。清除率=1-（D1-D2）/D0×100%。计算对ABTS自由基的清除率时，D1为ABTS工作液+黄酮样液的吸光度；D2为蒸馏水+黄酮样液的吸光度值；D0为ABTS工作液+60%乙醇的吸光度值。

1.3.6.2 清除DPPH自由基能力 参照李波等的方法[22]，配制0.15 mmol/L的DPPH储备液，4 ℃避光储存；现用现稀释，使其在517 nm处的吸光度为0.700±0.020，即为DPPH工作液；取DPPH工作液2 mL，加入不同洗脱物样液或维生素C、BHT溶液 2 mL，室温避光静置30 min，在517 nm处测吸光度D1，D2为无水乙醇代替DPPH工作液的吸光度，D0为60%乙醇代替洗脱物样液的吸光度，计算清除率。

1.3.6.3 清除羟自由基能力 参照周丽萍的等方法[23]，取6 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1 mL，加入6 mmol H2O2溶液1 mL，混匀；加入1 mL不同洗脱物样液或维生素C溶液，混匀静置10 min；加入6 mmol/L 水杨酸钠溶液1 mL，37 ℃水浴30 min；4 000 r/min离心10 min，取上清液在510 nm处测吸光度值D1，水杨酸钠溶液代替蒸馏水测得的吸光度值为D2，60%乙醇代替洗脱物样液的吸光度为D0，计算清除率。

1.3.6.4 还原铁离子能力 参照Wang等的方法[24]，向试管中加入洗脱物样液或维生素C、BHT溶液0.5 mL，再分别加入pH值为6.6的磷酸缓冲液，2.5 mL 5%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴20 min；冷水降温，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀，4 000 r/min离心10 min；取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁，静置10 min；在波长700 nm处测定吸光度值D1，以60%乙醇代替提取液的吸光度值为D0。还原铁离子能力计算公式为：总还原力=D1-D0。

1.4 曲线拟合与分析

采用CurveExpert 1.4 软件进行曲线拟合与数据分析。

2 结果与分析

2.1 芸香苷标准曲线

采用NaNO2-Al（NO3）3法绘制芸香苷标准曲线，得曲线方程为：y=0.014x+0.016 7，r2=0.998 5（图1）。

2.2 黄酮纯度分析

由表1可知，提取山核桃壳的黄酮纯度高低依次为：30%洗脱物>50%洗脱物>粗提物>70%洗脱物。

2.3 山核桃壳洗脱物及维生素C、BHT的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS自由基的能力 ABTS自由基常被用于衡量天然产物的总抗氧化能力。由图2可知，山核桃壳梯度洗脱物及抗氧化物质维生素C、BHT均对ABTS自由基有一定的清除作用，且随浓度增加，清除能力增强。由表2可知，洗脱物及抗氧化物质维生素C、BHT的半抑制浓度IC50值大小为70%洗脱物>50%洗脱物>30%洗脱物>BHT>维生素C，则其清除ABTS自由基的能力大小为维生素C>BHT>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物，山核桃壳乙醇梯度洗脱物对ABTS自由基有一定的清除作用，但清除作用低于维生素C和BHT，其中，30%洗脱物的清除能力最强。

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 由图3、图4、图5可知，山核桃壳梯度洗脱物及维生素C、BHT均对DPPH自由基有一定的清除作用，且随浓度增加，清除能力增强。由表3可知，IC50值大小依次为BHT>70%洗脱物>50%洗脱物>30%洗脱物>维生素C，则清除能力大小依次为维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物>BHT，山核桃壳乙醇梯度洗脱物对DPPH自由基的清除作用低于维生素C但高于BHT，这表明山核桃壳乙醇梯度洗脱物具有明显的DPPH自由基清除能力，其中以30%洗脱物的清除能力相对最强。

2.3.3 清除羟自由基的能力 由图6可知，长白山山核桃壳不同浓度的乙醇梯度洗脱物及维生素C均对羟自由基有一定的清除作用，且随浓度增加，清除能力增强。由表4可知，IC50值大小依次为70%洗脱物>50%洗脱物>30%洗脱物>维生素C，则清除能力大小依次为维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物，山核桃壳乙醇梯度洗脱物对羟自由基的清除作用明显低于维生素C。

2.3.4 还原铁离子的能力 由图7可知，还原铁离子能力大小依次为维生素C>BHT>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物，以山核桃壳30%洗脱物的还原铁离子能力相对最强，但均低于维生素C和BHT。

3 结论

以长白山山核桃壳为原料，采用超声波辅助提取粗提物，经大孔树脂柱层析，选择30%、50%、70%乙醇梯度洗脱，将洗脱物真空冷冻干燥，制得洗脱物冻干粉；采用分光光度法，测定洗脱物黄酮纯度；以维生素C、BHT为对照，研究洗脱物对ABTS、DPPH、羟自由基的清除能力和铁离子的还原能力。结果表明，粗提物黄酮的纯度为19.16%，30%洗脱物、50%洗脱物、70%洗脱物提取黄酮的纯度分别为56.90%、47.00%、18.47%；清除ABTS自由基能力大小依次为维生素C>BHT>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物，清除DPPH自由基的能力大小依次为维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物>BHT，清除羟自由基能力大小依次维生素C>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物，还原铁离子能力大小依次为维生素C>BHT>30%洗脱物>50%洗脱物>70%洗脱物。这表明黄酮纯度越高，其抗氧化活性越强，山核桃壳乙醇梯度洗脱物的抗氧化活性与黄酮纯度呈正相关，其中，以30%洗脱物的抗氧化性最强，可用于后续功能作用或生物活性的深入研究。

参考文献：

[1]朱红波，赵 云，林士杰，等. 核桃楸资源研究进展[J]. 中国农学通报，2011，27（25）：1-4.

[2]Park G，Jang D S，Oh M S. Juglans mandshurica leaf extract protects skin fibroblasts from damage by regulating the oxidative defensesystem[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，421（2）：343-348.

[3]Bae K. The medicinal plants of Korea[M]. Seoul：Kyo-HakPublishing Co.，2000.

[4]Xu H L，Yu X F，Qu S C，et al. Juglone，from Juglans mandshruica maxim，inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-dependent mechanism[J]. Food and Chemical Toxicology，2012，50（3/4）：590-596.

[5]于阳阳，包怡红. 碱溶性东北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析[J]. 食品科学，2012，33（18）：10-13.

[6]徐红艳，包怡红，杨丽芸. 响应面法优化超声波辅助提取胡桃楸种仁壳总黄酮工艺[J]. 食品工业科技，2012，33（17）：248-251.

[7]苑雅萍，赵洪云，秦香芹，等. 山核桃壳化学成分的研究[J]. 黑龙江医药，2006，19（1）：33-34.

[8]Shao P，He J Z，Sun P L，et al. Analysis of conditions formicrowave-assisted extraction of total water-soluble flavonoids from Perilla frutescens leaves[J]. Journal of Food Science and Technology，2012，49（1）：66-73.

[9]徐任生. 天然产物化学[M]. 北京：科学出版社，2004：526528.

[10]Li H，Cao D D，Yi J Y，et al. Identification of the flavonoids in mungbean （Phaseolus radiatus L.） soup and their antioxidant activities[J]. Food Chemistry，2012，135（4）：2942-2946.

[11]董 晶，张 焱，曹赵茹，等. 藜麦总黄酮的超声波法提取及抗氧化活性[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：267-269.

[12]郭志红，周鸿立. 玉米须多糖和黄酮的半仿生提取及抗氧化活性[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：273-276.

[13]王刚，王 东，饶力群. 苦瓜藤黄酮的富集工艺及抗氧化性能[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：277-279.[HJ1.73mm]

[14]Melidou M，Riganakos K，Galaris D. Protection against nuclear DNA damage offered by flavonoids in cells exposed to hydrogen peroxide：the role of Iron chelation[J]. Free Radical Biology & Medicine，2005，39（12）：1591-1600.

[15]李兆君. 3个荞麦品种黄酮含量及清除自由基活性比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（7）：355-356.

[16]Chen J，Li Y，Yang L Q，et al. Biological activities of flavonoids from pathogenic-infected Astragalus adsurgens[J]. Food Chemistry，2012，131（2）：546-551.

[17]Tripoli E，Guardia M L，Giammanco S，et al. Citrus flavonoids：molecular structure，biological activity and nutritional properties：areview[J]. Food Chemistry，2007，104（2）：466-479.

[18]Wang S Q，Zhu X F，Wang X N，et al. Flavonoids from Malus hupehensis and their cardioprotective effects against doxorubicin-induced toxicity in H9c2 cells[J]. Phytochemistry，2012，87（3）：119-125.

[19]Androutsopoulos V P，Papakyriakou A，Vourloumis D，et al. Dietary flavonoids in cancer therapy and prevention：substrates and inhibitors of cytochrome P450 CYP1 enzymes[J]. Pharmacology &Therapeutics，2010，126（1）：9-20.

[20]游 辉，孙爱东，唐 玲，等. 竹叶黄酮纯化中吸附剂的优选及解析特性研究[J]. 食品科学，2010，31（8）：24-27.

[21]程 超，朱玉昌，莫开菊. 零余子皂苷的抗氧化性研究究[J]. 食品科学，2007，28（10）：83-86.

[22]李 波，包怡红，高 锋，等. SephadexLH-20纯化红松松球鳞片多酚及其体外抗氧化研究[J]. 食品工业科技，2014，35（7）：57-61.

[23]周丽萍. Ralls苹果多酚分离及抗氧化与脂肪代谢调节作用研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2010.

[24]Wang C C，Chang S C，Stephen I B，et al. Isolation of carotenoids，flavonoids and polysaccharides from Lycium barbarum L.and evaluation of antioxidant activity[J]. Food Chemistry，2010，120（1）：184-192.