梵净山藤茶水提取物药效学初步研究

康超+王芳+刘盈盈+秦华军+席培宇+贾强

摘要：为研究梵净山藤茶水提取物（AGWE）对乙醇性肝损伤、血脂、血糖、血压的影响，通过构建急性毒性乙醇性肝损伤模型，考察不同剂量浓度的AGWE对小鼠的预防作用和SD大鼠肝损伤的保护作用，检测试验动物的死亡率、血清中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平；通过构建高血脂大鼠模型和四氧嘧啶构建糖尿病模型，经口灌胃AGWE，检测动物模型血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和血糖水平；制备大鼠胸动脉离体血管环，检测AGWE 对血管环的舒张作用。结果表明，AGWE降低了小鼠对乙醇致死的死亡率，增强了小鼠对乙醇急性毒性的耐受性；灌胃不同剂量的AGWE，可明显降低大鼠血清中ALT、AST水平，且呈剂量依赖；能显著降低血清TC、TG、葡萄糖水平（P<0.05），可以减少血管的收缩作用，使血管舒张。AGWE对乙醇性肝损伤、高血脂、高血糖、高血压均具有良好的保护作用。

关键词：藤茶水提物；乙醇性肝损伤；血脂；血糖；血压

中图分类号： R284.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0260-04

藤茶别称端午茶、藤婆茶、山甜茶、龙须茶、白茶、甘露茶、白毛猴等，系葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz） W.T.Wang]的嫩茎叶，主要分布于湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地[1]。藤茶中含有多种化学物质，如黄酮类、酚类、苷类、蛋白质、氨基酸等[1-3]，此外，还包括烷烃类、醛类、有机酸、醇类及甾醇类等多种挥发性物质[4]。研究表明，藤茶及其提取物具有抗菌消炎[5-7]、抗肿瘤[8-10]、抗氧化[11-12]、降血糖[13-15]、降血脂[16-18]、保肝护肝[19-20]等作用。梵净山位于贵州东北部，拥有同纬度地区保存最完好的亚热带原始森林，属亚热带山地湿润季风气候区，动植物资源丰富，拥有丰富而优质的野生藤茶资源。然而，关于梵净山藤茶的药理功效却未见报道。本研究首次报道梵净山野生藤茶提取物对血脂、血糖、血压的影响，探讨了梵净山藤茶的药理学作用，为梵净山藤茶的合理利用和产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 受试物

梵净山野生藤茶，采集自贵州省梵净山自然保护区的野生藤茶。

1.2 试验动物

NIH小鼠（批号：44007200006820），雌雄各半，清洁级标准，体质量18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供。SD大鼠[批号：SCXK-（粤）2008-0002]，雄性，清洁级标准，体质量180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供。Wistar大鼠[批号：SCXK-（粤）2008-0002]，雄性，体质量223.7～276.3 g，清洁级标准，共40只，由广东省医学实验动物中心提供。

1.3 试剂和仪器

试剂：99.7%乙醇（分析纯，杭州长征化工厂，批号：20100302）、联苯双酯滴丸（北京协和药厂）、地奥心血康（成都地奥制药集团有限公司）、四氧嘧啶（美国Sigma公司）、盐酸二甲双胍（贵州天安药业有限责任公司）、普萘洛尔（山西云鹏制药有限公司）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，自动生化分析仪（日立7100）、旋转蒸发仪（壹叶3100）、BL-420E生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），其他均为常规试剂和仪器。

1.4 方法

1.4.1 AGWE制备 将采集的梵净山藤茶的嫩枝叶粉碎，热水提取3次，合并滤液，浓缩成浸膏。给药时蒸馏水溶解为目的给药剂量，分别相当于生药200 mg/kg体质量和2 000 mg/kg 体质量。

1.4.2 动物分组及胸动脉离体血管环制备 （1）乙醇急性毒性学试验：将NIH小鼠随机分成5组，每组10只。

（2）乙醇急性毒性的预防试验：将NIH小鼠随机分成5组，即空白对照、乙醇对照组和AGWE低、中、高剂量组，每组10只。

（3）乙醇致肝损伤保护作用：将SD大鼠随机分成6组，即空白对照、阴性对照、阳性对照和AGWE低、中、高3个剂量组，每组10只。

（4）降血脂试验：将SD大鼠（雌雄各半）随机分成4组，即空白对照、模型组、阳性对照组和AGWE组，每组10只。除空白组外，其余组别SD大鼠连续给予高脂饲料（基础饲料87.3%、胆固醇2%、胆盐0.5%、猪油10%、甲基硫氧嘧啶0.2%[21]）14 d，空白组给予基础饲料。随机抽取每组30%的动物眼球后血管丛取血，检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平，确定动物模型。

（5）降血糖试验：将NIH小鼠随机分成4组，即空白对照、模型组、阳性对照和AGWE组，每组10只。将四氧嘧啶溶于生理盐水溶液中，配制为72 mg/kg。通过NIH小鼠尾静脉注射四氧嘧啶（72 mg/kg）生理盐水溶液，72 h后检测血清葡萄糖水平，以血糖值大于16 mmol/L作为造模成功标准。

（6）胸动脉离体血管环制备：Wistar大鼠断头处死，开胸迅速取出胸主动脉，置于预先用混合气体（95% O2和5% CO2）饱和的4 ℃的K-H溶液中，冲洗至无血迹，去除外周的脂肪组织和结缔组织，剪成2～3 mm长的血管环，将血管环置于盛有10 mL的K-H溶液（37 ℃恒温，并持续通入95% O2和5% CO2的混合气体，pH值=7.4）的恒温套瓶中。每一根血管环用2个三角型挂钩贯穿血管环管腔，一端固定，另一端连接于张力传感器，张力变化由BL-420E生物机能实验系统采集并记录。血管环加静息张力2 g左右，稳定90 min，期间每15 min用预温至37 ℃的K-H溶液更换液体，使血管环完全稳定。

1.4.3 试验方法 （1）乙醇急性毒性学试验：每组试验动物，分别灌胃不同剂量的乙醇1次，记录死亡数，并计算死亡率和半数致死剂量。

（2）乙醇急性毒性的预防试验：NIH大鼠随机分组后，每组给予半数致死量乙醇的同时给药。样品组给予不同剂量的AGWE（50、100、200 mg/mL），空白组和模型组给予等体积生理盐水，记录死亡数，并计算死亡率。

（3）乙醇致肝损伤保护作用：SD大鼠随机分组后，阳性对照组腹腔注射联苯双酯滴丸（0.2 g/kg），样品组腹腔分别注射AGWE低、中、高剂量（400、1 000、2 000 mg/kg），空白对照和模型组腹腔分别注射等体积生理盐水。1次/d，连续给药10 d，分别于第5、9天给药1 h后腹腔注射乙醇溶液（3 mL/kg），空白组注射等体积生理盐水，并于第10天给药4 h 后眼眶取血1 mL，3 000 r/min离心10 min，检测血清中ALT、AST含量。

（4）降血脂试验：高脂饲料饲养第15天开始给药，各试验动物组分别经口灌胃给药。样品供试组给药AGWE（2 000 mg/kg），阳性对照组给药地奥心血康（30 mg/kg），模型组和空白对照给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药28 d（末次给药后，禁食不禁饮8 h）。所有动物经眼球后血管丛采血，取血清检测血脂水平。

（5）降血糖试验：阳性对照组给药盐酸二甲双胍（150 mg/kg），样品供试组给药AGWE （200 mg/kg），对照组和模型组给予等体积生理盐水，1次/d，连续7 d。于末次给药后1 h，小鼠眼眶静脉丛取血测定血糖水平。

（6）降血压试验：先制备胸动脉离体血管环，待立体血管环稳定后，用60 mmol/L的KCl重复刺激3次，诱发血管的最大收缩幅度，连续3次同样的刺激，使血管收缩幅度<10%时，以此作为100%收缩张力。阳性药物组给药普萘洛尔（0.10 mg/kg），样品供试组给药AGWE（2 000 mg/kg），对照组给予体积60 mmol/L的KCl溶液。记录不同药物下血管环的张力变化，并计算舒张率，公式如下：

舒张率=加受试药后张力-加受试药前张力药物刺激后张力-药物刺激前张力×100%。

1.5 数据分析和处理

数据采用SPSS17.0软件进行统计学处理，结果取平均值，以x[TX-*5]±s表示，采用t检验进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 AGWE解酒护肝作用

2.1.1 乙醇急性毒性学试验 为研究乙醇对小鼠的急性毒性作用，分别给予不同剂量的乙醇1次，其死亡数和死亡率见表1。从表1可以看出，随着剂量的增加，死亡率逐渐上升。当乙醇剂量增加到12.46 g/kg时，死亡率达到100%。根据数据及半数致死量（LD50）的计算方法得出乙醇对小鼠的LD50为10.11 g/kg。

2.1.2 AGWE对乙醇急性毒性的预防试验 为考察不同AGWE浓度对乙醇急性毒性的预防作用，每组试验动物给予半数致死量乙醇的同时给予AGWE低、中、高剂量（分别相当于生药量50、100、200 mg/mL），结果见表2。从表2可以看出，随着AGWE浓度的增加，小鼠死亡率逐渐降低，从乙醇组的60%下降到AGWE高剂量组的20%，死亡率降低了66.7%，揭示AGWE增强了小鼠对乙醇急性毒性的耐受性。

2.1.3 AGWE对乙醇致肝损伤的保护作用 分别考察不同剂量的AGWE对乙醇致肝损伤的保护作用，结果见表3。从表3可以看出，与空白组比较，模型组血清中ALT、AST含量显著升高（P<0.01），揭示化学性肝损伤造模成功。与模型组比较，AGWE各剂量组和联苯双酯滴丸可显著降低大鼠血清中ALT含量（P<0.05）。AGWE中，高剂量和联苯双酯滴丸可显著降低大鼠血清中AST含量（P<0.05）。其中，AGWE 高剂量组对血清中ALT、AST作用与联苯双酯滴丸组相当，说明该提取物对乙醇性肝损伤具有明显的保护作用。此外，随着提取物剂量的逐渐增加，血清中ALT、AST含量逐渐减少，表明AGWE对乙醇性肝损伤的保护作用呈剂量依赖。

2.2 藤茶提取物对血脂的影响

连续给药28 d后，眼球后血管丛采血检测血脂水平，结果见表4。从表4可以看出，地奥心血康和AGWE（2 000 mg/kg）2个组的总胆固醇和甘油三酯水平显著低于模型组（P<0.05）。此外，藤茶水提取物组的胆固醇水平显著低于地奥心血康组（P<0.05），对甘油三酯的影响，两者之间无显著性差异。结果表明，AGWE能明显地降低胆固醇和甘油三酯水平，且优于地奥心血康。

2.3 藤茶水提取物对血糖的影响

连续给药7 d后，小眼眶静脉丛取血测定小鼠血糖水平，结果见表5。从表5可以看出，AGWE（200 mg/kg）和盐酸二甲双胍2个组的血糖水平明显低于模型组血糖水平（P<0.05），两者之间无显著性差异。结果表明，AGWE能明显降低小鼠血糖水平，与盐酸二甲双胍效果相当。

2.4 藤茶水提取物对血压的影响

当大鼠胸动脉离体血管环处于最大收缩张力时（收缩幅度<10%），用普萘洛尔和AGWE（2 000 mg/kg）分别对血管环进行刺激，记录血管舒张幅度并计算舒张率，结果见表6。从表6可以看出，在普萘洛尔和AGWE的刺激下，处于紧张的血管环明显舒张，其舒张率分别为（114.31±13.87）%和（103.23±12.31）%，与对照组比较，两者能明显减轻收缩幅度（P<0.01）。普萘洛尔和AGWE对血管有舒张作用，两者之间无显著性差异。结果表明，AGWE具有明显降血压作用，与普萘洛尔效果相当。

3 讨论

本试验研究了藤茶水提取物对乙醇性肝病、“三高”、抗炎症等作用。乙醇性肝病是我国常见的肝脏疾病之一，是由长期大量饮酒导致的，严重危害人的健康。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成乙醇性肝炎、肝纤维化和肝硬化。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。本研究通过灌胃乙醇建立大鼠急性毒性肝损伤模型，观察藤茶水提物对乙醇性肝损伤的保护作用。表明藤茶水提取物增强了小鼠对乙醇急性毒性的耐受性，明显降低了大鼠血清中ALT、AST含量，与之前研究结果一致[19-20，22]。乙醇在肝脏代谢过程中可产生大量的活性氧自由基（如OH-、O-2、H2O2）导致生物膜发生脂质过氧化反应，引起膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的损坏[23]；另一方面，产生的脂质过氧化物——丙二醛（MDA）可以与蛋白质、核酸（DNA、RNA）等大分子化合物交联，导致细胞和胞内细胞器代谢及功能障碍，甚至死亡[24]。AST主要分布于胞浆和线粒体，是一种线粒体酶，极易受到乙醇的影响[24]。梵净山藤茶水提取物能明显降低血清中AST水平，揭示了藤茶水提取物具有清除肝脏代谢过程中氧自由基，防止生物膜发生脂质过氧化反应的功能，从而达到保肝护肝的作用。

“三高”即高血脂、高血糖和高血压的简称，是导致心血管疾病的直接因素。如何有效控制高血脂、高血糖、高血压的发生，对心脑血管疾病的防治有着深远的意义。体质量指数（BMI）升高所致心血管风险部分由高血压、高血脂和高血糖介导，降低血压、血脂和血糖可使BMI升高引起的冠心病和卒中额外风险分别减少一半和3/4[25]。研究表明，藤茶总黄酮能降低血清TC、TG、LDL-C含量，减少肝系数和apoB/apoA比值，提高血清HDL-C含量[17-18]，且能降低阴虚小鼠血糖和饥饿小鼠肝糖原水平，增加胰岛素抗性[26]，能降低大鼠血糖值，改善血脂，升高胰岛素水平，并减轻胰岛细胞的损伤[15]。结果表明，梵净山藤茶水提取物能明显降低试验型血脂、血糖水平，达到降血脂、血糖的效果，与之前研究结果一致，同时揭示其具有潜在的减肥功效。此外，本试验研究了藤茶水提物对大鼠胸腔离体血管环的影响，表明藤茶水提取物能缓解由KCl刺激的血管紧张作用，表现了良好的降压效果。

本研究仅涉及水提取物的药效作用，对乙醇性肝损伤和“三高症”均有良好的效果，但对其具体的活性成分和作用机制尚未研究。藤茶含有多种化学成分，其中总黄酮的含量可达40%[27]，其保肝护肝、抗“三高”可能体现在黄酮类化合物上，其活性成分的筛选和药理作用机制有待后续研究。总之，梵净山具有独特的气候环境，拥有丰富、优质的野生藤茶资源，其药理活性的研究可为梵净山藤茶保健饮品和药用开发提供依据。

参考文献：

[1]罗祖友，付晓芳，吴谋成. 藤茶的研究进展[J]. 食品科学，2005，26（8）：513-517.

[2]Du Q Z，Chen P，Jerz G，et al. Preparative separation of flavonoidglycosides in leaves extract of Ampelopsis grossedentata usinghigh-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A，2004，1040（1）：147-149.

[3]Wang D Y，Zheng Z Z，Xu S Y，et al. Four new isoflavones fromAmpelopsis grossedentata[J]. Journal of Asian Natural ProductsResearch，2002，4（4）：303-308.

[4]郁浩翔，郁建平. 贵州梵净山藤茶及其近缘种广东蛇葡萄挥发性成分比较[J]. 山地农业生物学报，2012，31（6）：557-560.

[5]曾春晖，杨 柯，徐明光，等. 广西藤茶总黄酮对金黄色葡萄球菌抗菌机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：249-252.

[6]祁 佳，李莉霞，卜书红，等. 藤茶提取物清咽抗炎作用及其机制的研究[J]. 贵阳中医学院学报，2013，35（1）：19-21.

[7]陈 帅，郁建平. 藤茶总黄酮抗炎及抑菌作用的实验研究[J]. 贵阳中医学院学报，2013，35（1）：1-3.

[8]周春权，姚 欣，陈晓明，等. 藤茶提取物的抗肿瘤作用研究[J]. 中药新药与临床药理，2011，22（6）：640-642.

[9]郑作文，郭成贤，毛 健，等. 藤茶总黄酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用的实验研究[J]. 时珍国医国药，2009，20（5）：1158-1159.

[10]李 刚，郑作文，唐云丽. 藤茶总黄酮体外抗人肝癌细胞作用研究[J]. 中国药房，2008，19（9）：652-654.

[11]肖 浩，郑小江，朱玉婷. 藤茶多酚体外抗氧化作用[J]. 食品与生物技术学报，2011，30（5）：679-682.

[12]Wang Y F，Bian X Y，Park J，et al. Physicochemical properties，in vitro antioxidant activities and inhibitory potential againstα-glucosidase of polysaccharides from Ampelopsis grossedentata leaves and stems[J]. Molecules，2011，16（9）：7762-7772.

[13]钟正贤，覃洁萍，周桂芬，等. 广西藤茶总黄酮降血糖的实验研究[J]. 中国中药杂志，2002，27（9）：687-689.

[14]李玉山，李 田，戴清堂，等. 藤茶茶多糖对实验性糖尿病大鼠血糖的影响[J]. 营养学报，2006，28（4）：356-357，360.

[15]钟正贤，周桂芬，陈学芬，等. 藤茶总黄酮对链脲霉素所致糖尿病大鼠的降糖作用[J]. 中药药理与临床，2003，19（5）：19-20.

[16]刘翠娥，王海玉，王亚东，等. 藤茶辅助降血脂作用的研究[J]. 食品科学，2005，26（11）：237-241.

[17]李玉山，谭志鑫，李 田，等. 藤茶对大鼠高血脂和心肌酶的影响[J]. 营养学报，2006，28（6）：506-509.

[18]陈玉琼，倪德江，程 倩，等. 藤茶总黄酮及二氢杨梅素降血脂作用研究[J]. 茶叶科学，2007，27（3）：221-225，242.

[19]郑洁静，续洁琨，江 涛，等. 藤茶总黄酮对拘束负荷引起小鼠肝损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报，2006，22（10）：1249-1253.

[20]钟正贤，周桂芬，陈学芬，等. 广西藤茶中双氢杨梅树皮素保肝作用的实验研究[J]. 中国中医药科技，2002，9（3）：155-156.

[21]刘建文. 药理实验方法学——新技术与新方法[M]. 2版.北京：化学工业出版社，2008：259.

[22]钟正贤，覃洁萍，周桂芬，等. 广西藤茶总黄酮保肝作用的实验研究[J]. 广西科学，2002，9（1）：57-59，63.

[23]周晓娟，王 超. 槲皮素对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用[J]. 长江大学学报：自然科学版，2013，10（33）：8-10.

[24]徐迪波. 生姜乙醇提取物干预小鼠酒精性肝损伤及相关抗氧化活性研究[D]. 扬州：扬州大学，2010.

[25]Lu Y，Hajifathalian K，Ezzati M，et al. Metabolic mediators of the effects of body-mass index，overweight，and obesity on coronary heart disease and stroke：a pooled analysis of 97 prospective cohorts with 1.8 million participants[J]. The Lancet，2014，383：970-983.

[26]钟正贤，周桂芬，陈学芬，等. 藤茶总黄酮药理作用的实验研究[J]. 中国中医药科技，2004，11（4）：224-225.

[27]何桂霞，裴 刚，周天达. 显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定[J]. 中国中药杂志，2000，25（7）：423-425.