彩叶芋愈伤组织的诱导、增殖及植株再生

蔡小东+Zhanao+Deng

摘要：以Tapestry彩叶芋（Caladium ×hortulanum Birdsey）未展开叶片和叶柄薄层切片为外植体，研究了不同激素浓度配比对Tapestry彩叶芋愈伤组织的诱导、增殖及植株再生的影响。结果表明：在4种愈伤组织诱导培养基上均能产生愈伤组织，其中2 mg/L TDZ和1 mg/L 6-BA是彩叶芋愈伤组织诱导的最佳激素配比；叶柄薄层切片是诱导愈伤组织的理想外植体，其愈伤组织诱导率均在90%以上；愈伤组织在MS基本培养基上增殖率最高，愈伤组织质地致密，呈颗粒状；诱导的愈伤组织分化能力很强，在附加有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培养基上再生了许多幼苗。

关键词：彩叶芋；愈伤组织诱导；横切薄层培养；植株再生

中图分类号： S682.360.4+3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0075-03

彩叶芋（Caladium×hortulanum Birdsey）为天南星科彩叶芋属多年生草本观叶植物，又称花叶芋、五彩竿，原产南美洲热带地区。因其叶色、脉色、条纹、斑块艳丽夺目，观赏期较长，常常用于盆栽观赏、花圃栽培，在美化城市方面效果极佳[1-3]。为改良彩叶芋园艺性状，增加其观赏价值，培育新品种，常常采用商业品种与育种系列进行有性杂交[1-2]。然而，彩叶芋花偏少、花期不固定、花粉及种子寿命短等因素极大地影响了有性杂交育种效率[4]。而且，目前有性杂交育种最大的问题是，即使大量增加杂交后代的数量，杂交后代群体中新类型也越来越缺乏[1]。因此，有必要采用新的育种手段来培育彩叶芋新类型。

愈伤组织是快速繁殖、种质保存、体细胞诱变、原生质体培养和融合、遗传转化及有用化合物生产等研究的理想起始材料。建立彩叶芋愈伤组织诱导、增殖及再生体系，通过转化或体细胞杂交等方法进行彩叶芋品种的遗传改良，在彩叶芋生物技术研究中具有重要的意义。本试验对彩叶芋愈伤组织的诱导、增殖及小苗再生进行了研究，以期为将来彩叶芋生物技术育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Tapestry（Caladium×hortulanum Birdsey）彩叶芋是块茎繁殖苗，种植于美国佛罗里达大学海湾沿岸研究教育中心（the University of Floridas Gulf Coast Research and Education Center，Wimauma，Florida，U.S.A.）温室中。从温室中剪取生长良好的彩叶芋未展开叶片和未展开叶的叶柄备用。

1.2 外植体的处理

取Tapestry彩叶芋未展开叶片和叶柄，在自来水下冲洗30 min后先用75%乙醇浸泡15 s，再用0.5%二氯异氰尿酸钠（PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，Kansas，U.S.A.）外加2～3滴吐温-20浸泡20 min，其间轻轻振荡4～5次。消毒处理后叶片叶柄分别用无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干叶片和叶柄表面的水分。然后在超净工作台上用手术刀片将消毒后的叶片切成约0.5 cm×0.5 cm小块，叶柄则被横切成1.5～2.0 mm厚的薄片。

1.3 愈伤组织的诱导

以MS为基本培养基，在前人的研究[5-9]基础上共设计了4种培养基用于Tapestry彩叶芋2种外植体愈伤组织的诱导，分别为CI1：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；CI2：MS+1 mg/L TDZ+1 mg/L NAA；CI3：MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L BA；CI4：MS+1 mg/L TDZ+1 mg/L 2，4-D。所有培养基均添加20 g/L蔗糖和7.0 g/L琼脂，pH 值为5.8。每培养皿接种10～12个叶片切块或18～20个叶柄薄层切片，试验重复3次。接种后放入培养箱中进行暗培养，培养温度（25±2） ℃。60 d后统计愈伤组织诱导率。

1.4 愈伤组织的增殖

以MS为基本培养基，附加水解乳蛋白0.5 g/L及不同浓度的TDZ和KT，共设计5种培养基用于愈伤组织的增殖。将愈伤组织从原来的外植体上剥离下来，切成固定大小，称取约0.5 g愈伤组织分别接种于愈伤组织增殖培养基上，每种培养基接种5瓶。接种后进行暗培养，培养温度（25±2） ℃。30 d后统计愈伤组织增殖率。

愈伤组织增殖率=（增殖后质量-增殖前质量）/增殖前质量×100%。

1.5 植株再生

挑选直径在0.4 cm左右的愈伤组织块，转入含有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的分化培养基中，在光照条件下培养，光照度为2 000 lx 左右，光—暗周期16 h—8 h，温度（25±2） ℃。

2 结果与分析

2.1 2种外植体愈伤组织形成的过程

外植体接种7 d后开始观察愈伤组织的形成过程，结果如图1所示：虽然不同培养基均能诱导彩叶芋2种外植体产生愈伤组织，但这2种外植体愈伤组织形成过程各不相同。Tapestry彩叶芋未展开叶片切块在愈伤组织诱导培养基上培养10 d后，叶片边缘慢慢向上拱起，切口边缘处颜色渐渐变淡，开始膨大。培养1个月后，部分叶片切口附近开始出现淡黄色愈伤组织。培养2个月后，在添加有2 mg/L TDZ和1 mg/L BA的CI3培养基上叶片切口处再生了大量淡黄色颗粒状愈伤组织（图1-C），而在其他3种培养基上只再生了少量致密的愈伤组织（图1-A、B、D）。叶柄薄层切片愈伤组织发生时间要早10 d左右，培养20 d后，叶柄薄层切片边缘就开始出现愈伤组织。培养至2个月时，在这4种培养基上，叶柄薄层切片四周及表面即布满了大量淡黄色愈伤组织（图1-E、F、G、H）。并且在附加0.5 mg/L和0.1 mg/L 2，4-D的CI1培养基上（图1-A、E），2种外植体诱导的愈伤组织有少量分化出胚状体，甚至有芽和根的再生。这些在CI1培养基上再生的愈伤组织继续培养1个月后，愈伤组织体积继续增大，部分分化为胚状体，并且再生了许多具有根和芽的小苗。这说明CI1培养基非常适合于彩叶芋愈伤组织的分化。

2.2 不同激素组合对愈伤组织诱导率的影响

激素的种类及其浓度组合是调控外植体产生愈伤组织的主导因素。外植体接种在愈伤组织诱导培养基上2个月后，统计愈伤组织诱导率，结果如表2所示：这2种外植体在不同种类和浓度激素的诱导下，都能产生愈伤组织，但对不同种类激素的反应不同。对于未展开叶片切块，CI3培养基中愈伤组织诱导率高达92.8%，显著高于其他处理（P<0.05）。对于叶柄薄层切片，所设计的4种培养基中愈伤组织诱导率均在90%以上，其中CI3培养基中愈伤组织诱导率也是最高，达到97.9%，但这4种培养基愈伤组织诱导率之间没有显著性差异。这表明彩叶芋愈伤组织的诱导对激素的适应范围比较广，是很容易诱导愈伤组织的单子叶植物。叶柄薄层切片愈伤组织诱导效果优于叶片切块，而2 mg/L TDZ和1 mg/L6-BA 是彩叶芋愈伤组织诱导的理想激素组合。

2.3 不同激素组合对愈伤组织增殖的影响

虽然本研究中2种外植体在适宜的培养基上均能形成愈伤组织，但数量相对较少。为获得状态良好、足够数量的彩叶芋愈伤组织，需进行增殖培养。试验比较了不同浓度TDZ和NAA组合对彩叶芋愈伤组织增殖的影响。表2结果显示，培养1个月后，愈伤组织在这些培养基上均实现了不同程度的增殖。其中未添加任何激素的CP1培养基上，愈伤组织增殖率达到517.1%，显著高于其他处理。然而，如图2-A和2-B所示，这些愈伤组织在所有这些培养基上虽然能够快速增殖，但是愈伤组织仍然呈现颗粒状。少数愈伤组织再生了胚状体，甚至还再生了芽或根（图2-A），这可能是由于添加一定浓度的TDZ和NAA促使愈伤组织发生了分化。在解剖显微镜下观察发现，这些愈伤组织大多呈颗粒状，结构较致密（图2-C）。

2.4 小苗的再生

愈伤组织在附加有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培养基上培养1个月后，再生了大量带有根和芽的小苗。所有愈伤组织块均再生了带有芽和根的幼苗，且单个愈伤组织块可分化出多棵小苗。这些小苗叶片是绿色的，没有彩色叶脉和彩色斑点。当小苗长满培养瓶时，培养基表面还生长有大量愈伤组织和胚状体。

3 讨论

愈伤组织的产生是不同种类及浓度激素相互作用的结果。6-BA、2，4-D、TDZ等是外植体诱导愈伤组织所常采用的激素，6-BA能刺激愈伤组织的形成，2，4-D在诱导脱分化和细胞增殖方面效果较为明显，而TDZ是一种具有很强细胞分裂素活性的激素，具有促进愈伤组织生长的作用。前人研究表明，彩叶芋在组织培养中对生长调节剂的适应范围比较广[5-10]。如王颖等在试验中发现，彩叶芋在不同组合的激素培养下都能产生愈伤组织，再生出小植株，但是愈伤组织启动时间、愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率不同[7]。本研究发现，在4种不同激素配比的愈伤组织诱导培养基中均能产生愈伤组织，这与前人的研究结果是一致的。

此外，植物叶片、茎尖、叶柄、叶脉及子叶等是愈伤组织诱导常用的外植体。彩叶芋一般以叶片为外植体进行组织培养研究，叶柄薄层切片作为外植体在彩叶芋离体培养中鲜见报道[11]。横切薄层培养（transverse thin cell layer culture，tTCL）是指将外植体横切成大约1 mm厚的切片进行培养的方法。本研究中以彩叶芋未展开叶片和叶柄薄层切片为外植体，结果发现，叶柄薄层切片是诱导愈伤组织的理想外植体，其愈伤组织诱导率均在90%以上。这可能是由于薄层培养具有组织结构简单、对调控因子敏感、培养易成功等优点[12]。

优良的愈伤组织应具备质地疏松、增殖迅速、分化容易等特点[13]。状态良好的愈伤组织是原生质体操作、体细胞杂交、转基因、植株再生等的重要基础。本研究中获得的愈伤组织大多颗粒较大，结构致密，易于分化成苗，适合于组培快繁，但不适合于原生质体培养等研究。因此，彩叶芋愈伤组织在继代保存、愈伤组织悬浮系的建立等方面仍需进一步研究。

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