金线莲多倍体诱导研究

何碧珠+杨超+朱萍+蒋继宏

摘要：采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法、加入培养基法诱导金线莲多倍体，研究不同秋水仙素浓度、处理时间、处理方式金线莲多倍体的诱导效果，并将诱变植株进行繁殖。结果表明：以700 mg/L秋水仙素加入培养基处理15 h诱变率最高，达53.00%；以500 mg/L浸泡法处理24 h，诱导效果最佳，诱变率为51.67%；以700 mg/L涂抹法涂抹在金线莲茎节处诱导效果较好，诱变率为35.00%；3种多倍体诱导的效果顺序为加入培养基法>浸泡法>涂抹法。

关键词：金线莲；多倍体；秋水仙素；诱变率

中图分类号： S567.23+9.043 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0070-05

金线莲（Anoectochilus roxburghii）是我国传统珍贵药材，属兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus）植物[1]。由于人为掠夺性采挖，金线莲生境遭受严重破坏，加上金线莲自身繁殖特性，种子细小，发育不完全，自然状态下萌发率和繁殖率低下等特点，野生金线莲存量已越来越少[2-5]。多倍体植物具有营养器官大、抗逆性强、药用活性成分含量高等特性[6]。金线莲组织培养方面报道虽多[7-13]，但尚未见将一次性成苗培养技术应用于多倍体植株诱导方面应用的报道。本研究运用秋水仙素对一次性成苗培养植株进行多倍体诱导，以期为多倍体金线莲工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

将在福建省永泰藤山自然保护区赤壁景区内采集的野生苗一次性成苗培养的第二代瓶苗作为试验材料，选择生长一致、茎部粗壮的植株进行试验处理。

1.2 方法

采用3种方法进行多倍体诱导试验，每种方法均设置若干组处理时间和浓度梯度，研究不同取材部位（茎段、茎尖）、处理方法、秋水仙素浓度及处理时间对多倍体诱变率的影响。

1.2.1 秋水仙素溶液浸泡法 选取生长一致、茎节粗壮组培瓶苗，在无菌条件下将瓶苗植株切成长1～2 cm的带节茎段，放入经过高压灭菌浓度为300、500、700 mg/L的秋水仙素溶液分别浸泡10、20、30、40、50、60 h，每个处理重复3次，以无菌水浸泡处理材料为对照（CK）。将各处理后材料在超净工作台上用无菌水冲3～4遍后，接种在一次性成苗培养基MS+1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+150 g/L土豆+3%蔗糖+0.65%琼脂+0.2%活性炭上培养，将茎节和顶芽分开培养。培养条件：温度（23±2） ℃，光照强度1 000～1 500 lx，光照时间10 h/d。每瓶接种4个茎段或4个顶芽，每个处理接种5瓶，每个处理重复3次。

1.2.2 培养基添加 选取生长一致、茎节粗壮组培瓶苗，在无菌条件下将瓶苗切成长1～2 cm的带节茎段，接种到分别添加300、500、700 mg/L秋水仙素溶液的上述一次性成苗培养基上培养的植株，培养时间分别为5、10、15、20、25、30 d，以不加秋水仙素培养基为对照（CK），将处理后的材料转入不含秋水仙素的培养基中继续培养，将茎节和顶芽分开培养，培养条件同“1.2.1”节。每瓶接种4个茎段或4个顶芽，每个处理接种5瓶、重复3次。

1.2.3 秋水仙素蘸在材料处 选取生长一致、茎节粗壮组培瓶苗，在无菌条件下将瓶苗切成长1～2 cm的带节茎段，在超净工作台中用无菌棉签蘸上经高压灭菌的秋水仙素溶液，涂抹在茎节处，再将涂抹过秋水仙素的材料接种到“1.2.1”节所述一次性成苗培养基上培养的植株，将茎节和顶芽分开培养，秋水仙素溶液浓度分别为300、500、700 mg/L，共3个处理。每瓶接种4个茎段或4个顶芽，每个处理接种5瓶、重复3次，以无菌水处理材料为对照（CK）。

1.3 多倍体鉴定

1.3.1 形态学观察 从植株大小以及叶片大小、颜色、厚度等形态特征上比较经过秋水仙素处理的植株与对照植株的差异，从而初步筛选出诱导植株。分别测量培养3、5个月二倍体苗和四倍体苗叶长、叶宽、叶厚、茎直径、株高。

选择生长一致的诱导植株和对照植株，分别撕取叶片下表皮，置于载玻片上制成临时装片，在日本产Olympus倒置式生物显微镜下观察。在10×10倍镜下，随机选择10个视野，计算每个视野中的气孔数目；在10×40倍镜下，随机选择10个视野，测量视野中的气孔长度、宽度。

1.3.2 染色体观察 对外部形态和气孔明显变大的植株，采用改良苯酚品红染色法进行根尖染色体鉴定。在08：00—10：00切取植株根尖，先置于4 ℃冰箱中预处理8 h，后用卡诺固定液（冰乙酸 ∶乙醇=1 ∶3，V ∶V）在室温下固定18 h，蒸馏水漂洗2～3次后，用90%、80%、70%乙醇溶液各浸泡30 min，再用蒸馏水漂洗2～3次，用1 mol/L HCl溶液在60 ℃ 水浴中解离处理30 min，解离好的根尖用蒸馏水洗净并吸干水分，用改良苯酚品红溶液染色5 min压片，将压片置于显微镜下镜检观察染色条数。

2 结果与分析

2.1 金线莲多倍体诱导研究

2.1.1 浸泡处理对金线莲多倍体离体诱导效果 不同浓度秋水仙素溶液浸泡处理后培养1个月时，茎节处未出现芽萌动现象，顶芽没有伸长生长。培养2个月后，40%茎节间开始膨胀，腋芽发白，逐渐突起并伸长，抽出主芽，随后分化出二级、三级侧芽；5%生长出畸形芽；一部分出现褐化现象；一部分出现玻璃化现象；一部分刚开始有芽分化出来，随后逐渐萎蔫死亡。与对照相比，处理2、12 h对材料抑制作用不明显，芽长势好，侧芽多，部分处理长出丛生芽；处理24、36、48、60 h对材料生长抑制作用明显，茎段芽萌动缓慢，生长慢，侧芽较少。

比较秋水仙素溶液对茎节、顶芽生长的影响，茎节较顶芽容易分化出侧芽，顶芽未分化出芽，主要表现为伸长生长，生长较快。试验发现，秋水仙素对顶芽毒害作用比对茎节严重，顶芽生长受到明显抑制，顶芽膨大后，部分生长停止并逐渐死亡，相同秋水仙素溶液浓度、相同处理时间下，顶芽成活率明显低于茎节（图1）。

由表1可知，材料成活率随着秋水仙素溶液浓度升高、处理时间延长而逐渐降低，尤其以700 mg/L秋水仙素溶液处理60 h下，材料成活率最低，仅为13.33%。相同秋水仙素浓度下，随着处理时间延长，材料成活率也逐渐降低，300 mg/L秋水仙素溶液处理2 h下材料成活率为96.67%，而处理60 h时材料成活率降至35.00%；500 mg/L秋水仙素溶液处理2 h下材料成活率为93.33%，而处理60 h时材料成活率降至25.00%；700 mg/L秋水仙素溶液处理2 h下材料成活率为88.33%，而处理60 h时材料成活率降至13.33%。相同处理时间下，随着秋水仙素溶液浓度升高，材料成活率显著降低。

由表1可知，不同浓度秋水仙素溶液处理不同时间后，对四倍体诱变率的影响有显著差异。在相同秋水仙素浓度下，随着处理时间延长，四倍体诱变率先升高后降低。300 mg/L秋水仙素溶液处理2 h，诱变率为0%，而其他时间处理下诱变率为3.33%～48.33%，尤其是处理36 h下诱变率最高，为48.33%。500 mg/L秋水仙素溶液处理2 h，诱变率为0%，而其他时间处理下诱变率为8.33%～51.67%，尤其是处理24 h 下诱变率最高，为51.67%。700 mg/L秋水仙素溶液处理下诱变率为8.33%～50.00%，尤其是处理12 h下诱变率最高，为50.00%。秋水仙素对试验材料有一定伤害，随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长，伤害程度加重，导致死亡率升高，因此四倍体诱变率反而降低。

2.1.2 加入培养基法对多倍体离体诱导的效果 与对照相比，处理5 d对材料抑制作用不明显，芽长势好，侧芽多，部分长出丛生芽；处理10～30 d对材料生长抑制作用明显，茎段萌动缓慢，侧芽较少，顶芽生长慢。

将秋水仙素加入培养基中对茎节和顶芽生长产生一定影响，茎节较顶芽容易分化出侧芽，顶芽未分化出芽，主要表现为伸长生长，生长较快。观察发现，将秋水仙素加入培养基中对茎段毒害作用比对顶芽严重，茎段萌动受到明显抑制，部分不萌动并逐渐死亡，相同秋水仙素浓度、处理时间下，茎段成活率明显降低，这与浸泡处理结果相反。

由表2可知，将材料接种到加入不同浓度秋水仙素的培养基，培养时间对材料死亡率产生影响。随着秋水仙素溶液浓度升高、培养时间延长，材料死亡率随之升高，尤其以700 mg/L 秋水仙素处理30 d，材料死亡率最高，为80.00%。低浓度秋水仙素下，延长处理时间，材料死亡率保持在相对较低水平；高浓度秋水仙素下，延长处理时间，材料死亡率升高很快。

由表2还可知，低浓度秋水仙素下，延长处理时间，诱变率没有明显增加；高浓度秋水仙素下，延长处理时间，诱变率先升高后降低。300 mg/L秋水仙素溶液处理5～30 d，诱变率为0%～13.33%；而700 mg/L秋水仙素溶液处理5～30 d，诱变率从8.33%上升至53.33%后，又降至15.00%。秋水仙素对材料有一定伤害，随着浓度升高和处理时间延长，伤害程度加重，导致死亡率升高，因此四倍体诱变率反而降低。

2.1.3 涂抹法对多倍体离体诱导效果的影响 涂抹法较浸泡法、加入培养基法对材料伤害作用较轻，且节约药品，但对四倍体诱导效果明显较差。由表3可见，秋水仙素浓度为300 mg/L时，四倍体诱变率为13.33%，随着秋水仙素浓度升高诱变率逐渐增加，当秋水仙素浓度为700 mg/L时，诱变率为35.00%，诱导效果明显不如浸泡法、加入培养基法，因此该方法不适用于金线莲多倍体诱导。

2.2 诱导植株形态学观察

与对照相比，处理组植株在株高、茎粗、叶片大小、叶片厚度、茎节等外部形态特征上发生明显变化。对茎段处理后，前期诱导分化慢，营养器官明显增大，主要表现在植株高大，茎秆粗壮，茎节明显且长，叶片肥厚，叶片变小，叶脉金色加深等，与二倍体差异明显（表4）。

气孔大小、气孔密度及保卫细胞大小等可作为鉴定多倍体与二倍体的间接指标[14-17]。镜检发现，诱导植株气孔明显增大，气孔长度、宽度均明显大于对照植株（图2-a至图2-d）。由表5可见，诱导植株气孔为44.64 μm×27.78 μm，对照植株气孔为32.24 μm×17.36 μm，诱导植株气孔长度、宽度分别比正常植株增加38.46%、37.51%。每个视野气孔数量明显少于对照植株，为对照植株的53.85%。

2.3 诱导植株根尖染色体数目观察

从形态学和解剖学上初步筛选出诱导植株，进行根尖染色体鉴定。曾雅娟等研究表明，金线莲染色体数目为2n=40[18]。对诱导植株和对照植株进行根尖染色体制片（图2-e、图2-f），由于金线莲染色体数目较多，染色体出现重叠，未能清晰算出染色体数目，但可以明显看出诱导植株根尖细胞体积变大，细胞核增大，部分细胞形态发生变化，染色体数目增多。

3 结论与讨论

将化学诱导剂和组织培养技术相结合进行人工诱导多倍体，已经在许多植物上取得成功。以往研究表明，掌握秋水仙素浓度及处理时间是多倍体诱导成功的关键[19-21]。秋水仙素浓度太低或处理时间太短无法达到诱导目的；而秋水仙素浓度过高或处理时间太长，虽能达到诱导效果，但植株受伤害严重，死亡率高。秋水仙素诱导处理方法有浸泡法、涂抹法、注射法、加入培养基等方法，在实际操作中常需要根据植物材料和部位选择适宜的处理方法。

本研究采用浸泡、涂抹、加入培养基等3种方法来诱导多倍体。其中浸泡法以500 mg/L秋水仙素溶液处理24 h下诱导效果最佳，诱变率为51.67%，这与蔡文燕等的研究结果略有差异，蔡文燕等用0.1%、0.2%的秋水仙素溶液浸泡，结果表明，用0.1%秋水仙素浸泡48 h条件下，诱导效果最好，诱变率为48%[22]。这说明相同处理方法下，秋水仙素浓度不同，诱导效果也会不同，诱导效果还与培养时间、培养方法有关，金线莲品种差异、取材部位与时间不同等都会影响试验结果。在秋水仙素加入培养基试验中，以700 mg/L秋水仙素处理15 d诱变率最高，达53%。王丽芳等用300 mg/L秋水仙素处理金线莲茎段、顶芽3～19 d，结果表明处理13 d的加倍效果最好，加倍率为72%[23]；而本研究中用300 mg/L秋水仙素处理15 d，诱变率仅为5%，这与王丽芳等研究结果不一致。涂抹法中，以700 mg/L秋水仙素涂抹在茎节的诱导效果较好，诱变率为35%，涂抹法的诱变率较浸泡法、加入培养基法低，但对材料伤害作用较轻，同时也节省药品。

秋水仙素处理后外植体前期诱导分化慢，后期生长较快，营养器官明显增大，表现为植株高大、茎秆粗壮、茎节多且明显，叶片变多、变短且肥厚，叶脉金色加深等特点；诱导植株气孔明显增大，气孔长度和宽度均显著大于对照，其形态和气孔特征的诱导与通常的多倍体诱导结果一致[24-26]。

测得组培苗阶段二倍体苗、多倍体苗的多糖含量分别从10.13%、14.05%上升到15.91%、18.91%，多倍体瓶苗在大棚栽培6个月后多糖含量为9.69%，而二倍体苗在大棚栽培6个月后多糖含量仅为8.77%，可见在相同栽培环境下，多倍体植株栽培6个月多糖含量高于二倍体植株。由此可知，多倍体金线莲的多糖含量高于二倍体植株，得出多倍体苗多糖含量高于二倍体植株，这与多倍体营养成分增加的特点一致，多倍体瓶苗多糖含量高于二倍体瓶苗，这与Olimpienko等研究发现四倍体铁皮石斛的可溶性糖含量高于二倍体的研究结果[27]一致。

测得二倍体苗、多倍体苗总黄酮含量分别从1.17%、1.24%上升到1.27%、1.38%。得出多倍体苗总黄酮含量高于二倍体植株，这进一步证明了多倍体营养成分增加的特点，测得大棚栽培6个月的二倍体栽培苗、多倍体栽培苗总黄酮含量分别为1.47%、1.92%，栽培6个月时多倍体植株多糖、总黄酮含量高于二倍体植株（多倍体苗总黄酮含量接近野生苗的1.97倍）。对赤壁金线莲组培苗和栽培苗进行总黄酮含量的测定，发现其均含有黄酮类物质，这与曾建军等研究认为金线莲组培苗富含黄酮类物质的报道[8]一致。组培苗黄酮含量随着培养时间延长而增多，移栽后总黄酮含量进一步增加，黄酮是植物体内的次生代谢产物，其含量变化受外界条件影响，如光照刺激等对其合成有帮助[28-29]。将金线莲移栽到光照等条件较好的外界环境中，有利于黄酮积累。

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