基于RAPD标记的新疆荒漠稻区稻水象甲遗传多样性分析

王小武，付开赟，丁新华，吐尔逊·阿合买提，何江，郭文超

(1.石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)



基于RAPD标记的新疆荒漠稻区稻水象甲遗传多样性分析

王小武1，付开赟2，丁新华2，吐尔逊·阿合买提2，何江2，郭文超2

(1.石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

【目的】研究新疆荒漠稻区稻水象甲种群的遗传结构及入侵途径，为稻水象甲的监测、有效控制提供参考。【方法】采用RAPD分子标记，对新疆各稻区及内地北方典型稻区7个不同地理种群105头稻水象甲个体的遗传多样性进行分析。【结果】28条RAPD随机引物中筛选出7条多态性好的引物，共扩增出139条条带，多态性条带为98条，其多态性位点百分率(PPB)为70.5%。新疆伊宁察县稻水象甲地理种群基因多样性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龙江阿城最高(PPB：62.58%、H：0.300 6、I：0.445 0)；7个地理种群之间的Gst(基因分化系数)为 0.199 5，稻水象甲各种群间遗传变异为19.95%，种群内遗传变异为80. 05%，不同地理种群间遗传分化水平较高。7个地理种群的UPGMA聚类结果显示：河北唐山市和吉林公主岭市的地理种群优先聚在一起，其亲缘关系最近，接着依次与黑龙江阿城市、新疆伊宁察布查尔县及霍城县完成第一个聚类；新疆乌鲁木齐市米东区和新疆五家渠市则完成第二个聚类。【结论】稻水象甲不同地理种群遗传多样性不同且存在差异。新疆荒漠稻区稻水象甲随引种、稻草、交通工具等人为的从东北传入的可能性大。

稻水象甲：RAPD：遗传分化

0 引 言

【研究意义】稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel产于美国南部地区[1]，该虫繁殖力强、适生性强、传播快速，防控难度大，故被国际自然保护联盟(IΜCN)列为最具威胁的100种外来入侵生物之一[2]，也是我国重要的对外检疫性对象之一[3]。1988年在我国河北省唐海县发现[4]，随后该虫便在我国迅速传播扩散，截止2010年，其疫区已扩大到23个省(直辖市和自治区)[5]，依次为台湾、天津、北京、山东、辽宁、吉林、福建、浙江、湖南、安徽、江西、江苏、广东、广西、山西、陕西、云南、内蒙古、黑龙江、湖北、贵州和新疆等，且有进一步向周边省份蔓延的趋势，对我国及稻米生产带来了威胁。【前人研究进展】有关稻水象甲的研究，国内外学者大多集中于其生物学、生态学和综合防治等方面，如：关志坚[6]、郭文超[7-8]、NILAKHESS[9]、孙富余[10]、王小武[11]等对稻水象甲生物学特性及其种群迁移扩散规律进行了研究；王刚[12]、翟保平[13]、LEE[14]等对稻水象甲生活习性、生活史、及迁飞影响因子的研究；黄雅文[15]对稻水象甲空间分布型的研究。孙富余[10]、付文君[16]、班晓丽[17]等进行了稻水象多种防控措施的研究。以上研究虽对稻水象甲的有效防控起到了积极作用，但仍未能遏制稻水象甲的传播蔓延。因此，很有必要进行稻水象甲种群的遗传分化情况研究，探讨其入侵传播扩散的分子机制。目前，有关稻水象甲遗传多样性研究，在国内仅见少量报道。李志强[18]运用RAPD-PCR技术分析了辽宁省不同地域稻水象甲的遗传多样性以探明该物种在辽宁省内的传播途径；柳青[19]等采用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记技术分析了我国内地13个省28个地区稻水象甲的遗传多样性，杨璞[20]利用AFLP对两种生殖方式稻水象甲种群多态性进行了研究，结果表明，两性生殖和孤雌生殖类群的相似系数较低，两者的亲缘关系较远。在分子标记技术中，RAPD (random amplified polymorphic)最早是由Black应用于蚜虫的种及种群鉴定和区分[21]。目前，RAPD分子标记技术已应用在寄生蜂、舞毒蛾、棉铃虫、蚜虫、按蚊、蝗虫、果蝇、粉虱、蜜蜂等昆虫中，因其操作简单、对引物没有严格的界限、对样品DNA的质量要求不高且不需事先知道材料的基因信息，故其已成为昆虫遗传结构研究中的一种普遍方法[22]，而涉及稻水象甲RAPD分子标记的研究在新疆尚未见报道。【本研究切入点】目前，有关稻水象甲遗传多样性研究，在国内仅见少量报道。选取RAPD分子标记技术开展新疆各稻区稻水象甲不同地理种群间，及其与内地北方典型稻区种群遗传结构、遗传多样性进行研究，揭示新疆荒漠稻区稻水象甲种群的遗传结构及入侵途径。【拟解决的关键问题】通过对新疆各稻区稻水象甲不同地理种群间及其与内地北方典型稻区稻水象甲进行RAPD分子标记，揭示新疆稻区稻水象甲种群的遗传结构及入侵途径，指导新疆科学制定稻水象甲的封锁与防控措施，进一步有效阻止或延缓其传播扩散提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验以稻水象甲成虫为材料，分别采集于我国4个省份7个地理种群。样本采集后置于-80℃冰箱保存以备用。表1

表1 供试稻水象甲信息来源
Table 1 The specimens tested of Lissorhoptrus oryzophilus

序号No．地理种群代码CodeofPopulation采集地Location样本个数Samplesize经度Lon纬度Lat1HLJAC黑龙江阿城市151270945232JIGZL吉林公主岭市151244343263HBTS河北唐山市151183739574XJYNQapqal新疆伊宁市察布查尔县15812043905XJMD新疆乌鲁木齐市米东区15876843776XJYNHC新疆伊宁市霍城县15814443467XJWJQ新疆五家渠市158732444

1.2 方 法

1.2.1 稻水象甲DNA提取

稻水象甲总DNA的提取利用FFPE DNA Kit固定组织基因组DNA提取试剂盒(Cwbio)完成。具体步骤：(1)将单头成虫稻水象甲后放入小型研磨中，加入180 μL Beffer GTL和20 μL Proteinase K研磨。(2) 56℃ 孵育1 h，直至样品完全溶解；90℃孵育1 h，短暂离心。(3)加入200 μL Buffer GL,涡旋震荡，加入200 μL无水乙醇，涡旋震荡，短暂离心。(4)将步骤(3)所得溶液全部加入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DS)中。10 000 r/min离心1 min，弃废液。(5)加入500 μL Buffer GW1，10 000 r/min离心1 min，弃废液。(6)加入500 μL Buffer GW2，1 000 r/min离心1 min，弃废液。(7)12 000 r/min离心2 min，弃废液，静置数分钟。(8)将吸附柱置于新的离心管，加入20～100 μL Beffer GE或灭菌水，室温放置2～5 min，10 000 r/min离心1 min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。

1.2.2 RAPD标记

从28条随机引物(Biomed)中筛选出7条多态性强、重复性较好的引物，并用这7条引物，对7个地理种群稻水象甲总DNA进行RAPD-PCR。RAPD反应体系为25 μL，其中包括10.5 μL ddH2O ，12.5 μL 2xTaqPCR Master Mix(Cwbio)，1 μL模板DNA，1 μL引物。扩增程序为：95 ℃预变性5 min；3个循环：94℃变性1 min，42℃退火1.5 min ，72℃下延伸2 min。随后进行第二次循环；共40个循环：94℃变性1 min，45℃1.5 min，72℃延伸2 min。循环结束后于72℃条件下完全延伸9 min。 PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，染料为GoldView I型核酸染色剂(zomanbio)，Marker为DL2000(Cwbio)，电泳条件为100 V，45 min，随后在 Image Lab凝胶成像系统上检测拍照。

1.3 数据统计

用RAPD随机引物扩增出的每一个基因型、片段/条带均视为一个分子标记，凝胶图谱上的条带按有带或弱带赋值“1”，无带的赋值“0”，形成二进制“0，1”矩阵，用POPGENE 1.32软件计算不同地理种群遗传多样性参数。基于Nei's遗传距离，按UPGMA (不加权成对算术平均法) 法对不同地理种群进行聚类分析[21]。

2 结果与分析

2.1 RAPD引物筛选及PCR扩增结果

对7个地理种群105头稻水象甲个体进行RAPD-PCR分析。研究表明，从28条RAPD随机引物中筛选出7条多态性较好的引物，扩增出139条条带，每条引物平均扩增条带19.85条，多态性条带16条，多态性位点百分率(PPB)为70.5%。其中OPP11扩增总条带数最多，为26条，OPE-1多态性条带数最多，为21条；引物OPO18扩增总条带数最少，为10条，引物OPO18多态性条带数最少，为7条。OPE-1多态性位点百分率最高，达84.0%，G13最低，为52.4%。7条引物均获得较为理想的DNA图谱。表2，图1，图2

表2 RAPD引物序列及其扩增
Table 2 RAPD primer sequences and amplification resμlts

引物Primer序列(5＇to3＇)Sequence(5＇to3＇)扩增总带数Numberofamplifiedbands多态性条数Numberofpolymorphicbands多态性位点百分率(%)PercentageofpolymorphismbandsA16AGCCAGCGAA16138125G13CTCTCCGCCA21115240OPE-1CCCAAGGTCC252184OPE-3GGTGCGGGAA24166667OPO18CTCGCTATCC10770P2GTTTCGCTCC17116471OPP11AACGCGTCGG26197308

图1 引物a16对五家渠地理种群扩增的RAPD带型

Fig.1 RAPD bands of XJWJQ population samples of using primer a16

图2 引物ope-1对察布查尔县地理种群扩增的RAPD带型

Fig.2 RAPD bands of XJCX population samples of using primer a16

2.2 稻水象甲地理种群遗传多样性

稻水象甲7个不同地理种群的遗传多样表明，新疆伊宁察布查尔县地理种群基因多样性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龙江阿城最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)。表3

7个地理种群之间的Gst(基因分化系数)为 0.199 5，稻水象甲各种群间遗传变异为19.95%，种群内为80.05%，种群内的遗传分化水平较高，种群内基因多样性Hs为0.269。其种群间基因流Nm 为 2.006 8。表4

表3 稻水象甲种群遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of Lissorhoptrus oryzophilus populations

地理种群Geographicalpopulation等位基因数(Na)Numberofalleles有效等位基因数(Ne)EffectivenumberofallelesNei＇s基因多样性指数(H)Nei＇sindexShannon信息多样性指数(I)Shannon＇sindex多态位点数No．ofpolymorphicloci多态位点百分率(%)PPBHLJAC18878±0380615016±0347503006±0159204450±02423876258JIGZL18265±0317314819±0325602850±0176304285±02139825899HBTS18367±0371514474±0342702699±0170604123±02330785612XJYNQapqal16633±0475013402±0329002106±0180703239±02606654676XJMD18265±0380614878±0349002872±0177904310±02441785612XJYNHC18061±0397414807±0360302817±0181504225±02500815827XJWJQ17959±0405114029±0330302482±0170903825±02383795684Average18061±0389614489±0340602690±0173904080±02403795684SpeciesLevel19764±0214515472±0256703361±0108905119±01281987050

注：表中数据均为平均值±标准差，下同

Notes：Date in the Table are mean ±SE, the same as below

表4 由Nei's指数估计的稻水象甲种群遗传分化系数及基因流
Table 4 Coefficients of the genetic diversity and gene flow of Lissorhoptrus oryzophilus popμlations by Nei's index

总基因多样性(Ht)Totalgeneticdiversity种群内基因多样性(Hs)Geneticdiversitywithinpopulations基因分化系数(Gst)Coefficientofgeneticdifferentiation基因(Nm)Geneflow03361±001190269±000770199520068

2.3 稻水象甲地理种群的聚类分析

由稻水象甲不同地理种群间Nei's遗传一致度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)可得：7个地理种群中，新疆乌鲁木齐市米东区和黑龙江阿城市地理种群相似度最低为0.876 3，而河北唐山市和吉林公主岭市最高为0.949 7；河北唐山市和吉林公主岭市的遗传距离最近为0.051 6，黑龙江阿城市和新疆伊宁市霍城县的最远为0.133 7。根据Nei's(1978)遗传距离数据，构建7个地理种群的UPGMA聚类系统树，研究表明，吉林公主岭市、河北唐山市、黑龙江阿城市、新疆伊宁市察布查尔县及新疆伊宁霍城县5个地理种群完成第一个聚类，形成第一个分支，其中河北唐山市和吉林公主岭市的地理种群优先聚在一起，表明其亲缘关系最近，接着依次与黑龙江阿城市、新疆伊宁察布查尔县及新疆伊宁霍城县的分支完成第一个聚类；新疆乌鲁木齐市米东区和新疆五家渠市则完成第二个聚类。表5，图3

表5 稻水象甲不同地里种群间Nei's遗传一致度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
Table 5 Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

popID12345671∗∗∗∗090860903008748087710932109017200958∗∗∗∗092740936708802094970885630102100754∗∗∗∗090590906509159090274013370065400988∗∗∗∗087630931408764501311012760098201321∗∗∗∗089520903060070300516008790071001107∗∗∗∗091527010350121501024013190102000886∗∗∗∗

图3 稻水象甲Nei's (1978)遗传距离系统树
Fig.3 The dendrogram Based Nei's (1978) Genetic distance for Lissorhoptrus oryzophilus

3 讨 论

3.1 新疆稻区与我国东北水稻产区基本处于同一纬度区域，热量资源相同，种植模式相同，均是一年一季；再者新疆稻区大多品种主要引自东北地区[23]，而河北唐山是稻水象甲最初入侵地，东北地区和河北地区均属于我国典型的水稻种植区，因此判断，新疆稻区的稻水象甲可能由上述地区入侵。故研究采用RAPD标记对7个地理种群稻水象甲(均采自北方典型稻区)进行了遗传特性分析，结果表明，稻水象甲不同地理种群多态位点百分率(%) PPB 、Nei's基因多样性指数(H)、Shannon's多样性信息指数(I)均不同，其中黑龙江阿城市地理种群的遗传多样性最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)，而新疆伊宁察布查尔县地理种群的遗传多样性最低(PPB : 46.76%、H: 0.210 6、I:0.322 9)。表明我国新疆和北方典型稻区不同地理种群中，稻水象甲的种群遗传多样性丰富度不同且存在遗传差异。这一结论与柳青[19]等研究类似。

3.2 Nei's遗传多样性指数估计的稻水象甲7个地理种群之间的基因分化系数Gst为0.199 5，表明各地理种群间的遗传变异为19.95%，种群内的遗传变异为80.05%，种群内的遗传分化水平较高；这一研究结果与柳青等[19]研究结果相反，其认为稻水象甲种群间的遗传分化水平较高。上述有关导致稻水象甲成虫在我国不同地区遗传分化差异的原因还有待于进一步研究。

3.3 聚类分析结果显示，7个地理种群聚成两大分支。其中，新疆伊犁河谷地区察布查尔县和霍城县聚在第一个分支，新疆乌鲁木齐市米东区和新疆五家渠市聚成第二个分支，四个地理种群并未聚到一起。这表明新疆的稻水象甲可能存在不同来源，乌鲁木齐市米东区和五家渠市两个地理种群来源于同一区域，而伊犁河谷地区察布查尔县和霍城县的两个地理种群为同一个来源。而且据调查，2010年前后伊犁河谷察布查尔县曾在东北稻水象甲发生区引进过水稻种子。因此，伊犁河谷地区稻水象甲来源于东北吉林省或黑龙江省可能性较大，而乌鲁木齐市米东区和五家渠市两个地理种群来源于我国其他稻水象甲发生区。从发生时间顺序上看，新疆稻区四个地理种群属同一来源的可能性更大。

3.4 齐国君等[5]认为；稻水象甲首先入侵港口城市，其次出现于铁路/公路沿线城市；柳青等[19]研究表明，在我国稻水象甲扩散路线是复杂的且呈多向性。对于研究而言，稻水象甲在我国扩散主要受人为因素、交通贸易影响较大(如引种、稻草)。从聚类的结果看，吉林公主岭市和河北唐山市的地理种群优先聚类，其亲缘关系最近，接着依次与黑龙江阿城市、新疆伊宁察布查尔县及霍城县的分支完成聚类，最后和新疆米东区、五家渠市的地理种群聚类。因此，推测新疆地区的稻水象甲可能是随引种、稻草、交通工具等人为的从东北传入。

4 结 论

4.1 对7个地理种群105头稻水象甲个体进行RAPD-PCR分析。结果表明，从28条随机引物中筛选出7条多态性好的引物，共扩增出139个条带，平均每条引物扩增条带为19.85条，多态性条带为16条，多态性位点百分率(PPB)为70.5%。

4.2 稻水象甲7个不同地理种群的遗传多样。新疆伊宁市察布查尔县地理种群基因多样性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龙江阿城市最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)。7地理种群之间的基因分化系数Gst 为 0.199 5，稻水象甲各种群间遗传变异为19.95%，种群内为80.05%。种群间基因流Nm为2.006 8，各地理种群间遗传分化水平较高。

4.3 稻水象甲7个地理种群的UPGMA聚类结果显示：吉林公主岭市、河北唐山市、黑龙江阿城市、新疆伊宁市察布查尔县及霍城县5个地理种群完成第一个聚类，形成第一个分支；新疆乌鲁木齐市米东区和新疆五家渠市则完成第二个聚类，形成第二个分支。表明新疆稻区的稻水象甲可能存在不同来源，乌鲁木齐市米东区和五家渠市两个地理种群来源于同一区域，而伊犁河谷地区察布查尔县和霍城县的两个地理种群为同一个来源。伊犁河谷地区稻水象甲来源于东北吉林省或黑龙江省可能性较大，而乌鲁木齐市米东区和五家渠市两个地理种群来源于我国其他稻水象甲发生区。从发生时间顺序上看，新疆稻区不同地理种群属同一来源的可能性更大。

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Fund project:The national key research project "The dynamic distribution and resource database construction of the main invading organisms"(2016YFC1202100); the basic science and technology research support funds of non-profit research institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "rice water weevil monitoring and control techniques of green control technology research" (KY2015061), the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "rice water weevil adaptability and genetic analysis in Xinjiang diversity "(xjnkq-2014003)

Analysis on Genetic Diversity of the Rice Water Weevil Based on RAPD Markers in the Ecological Regions of Oasis in Xinjiang

WANG Xiao-wu1, FU Kai-yun2, DING Xin-hua2, Tuerxun·Ahemaiti2, HE Jiang2, GUO Wen-chao2

(1.College of Agronomy, Shihezhi University, Shihezi Xinjiang 832000, China; 2. Key Laboratory ofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The objective of this experiment is to study the genetic structure and invasive route ofL.oryzophilusin the hope of providing references that might be important for accurate monitoring and effective control of rice weevils.【Method】TheL.oryzophiluswere collected from 7 different geographic populations of 105 individual from Xinjiang and north typical rice planting areas in China which was analyzed by using the RAPD molecular markers in order to investigate the genetic diversity of the populations.【Result】7 good polymorphic RAPD primers that was finally-screened from 28 the random primers produced a total of 139 bands, of which 98 were polymorphic. The Polymorphism loci percentage(PPB)was 70.5% . The genetic diversity of the XJYNQ -apqal populations was the lowest (PPB：46.76%,H：0.210,6,I：0.323,9)，while HLJAC was the highest (PPB：62.58 %,H：0.300,6,I：0.445,0)The coefficient of genetic differentiation among populations Gst was 0.199,5, including 19.95% genetic variation partitioned among populations, 80.05% within populations. It was showed higher levels of genetic differentiation between different geographic populations. 7 geographical populations of UPGMA clustering results showed that: Tangshan City in Hebei Provice, Gongzhuling in Jilin Province, Hebei City, the geographical population is a priority, which indicated the close genetic relationship. Followed by are Acheng City in Heilongjiang Provice and Qapqal and Huocheng County in Yili area. These places completed the first cluster, while the other populations in Wujiaqu city and Midong district constituted the second cluster.【Conclusion】The richness of genetic diversity of theL.oryzophilusdifferent geographic populations is different and have genetic difference in China. The rice water weevil,L.oryzophilusKuschel in the ecological regions of oasis in Xin-jiang were probably invaded from Northeast rice planting areas in China in the course of introduction, such as straws and traffic tools by the people.

LissorhoptrusoryzophilusKusche；RAPD；genetic differentiation

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.11.014

2016-05-04

国家重点研发计划项目“主要入侵生物的动态分布与资源库建设”(2016YFC1202100)；自治区公益性科研院所基本科研业务费专项项目“稻水象甲监测及绿色防控技术研究”(KY2015061)；新疆农业科学院青年基金项目“稻水象甲在新疆的适生性分析及遗传多样性研究”(xjnkq-2014003)

王小武(1990-)，男，宁夏人，硕士研究生，研究方向为农业昆虫与害虫防治，(E-mail)wxw303528@163.com

郭文超(1966-)，男，河北人，研究员，研究方向为害虫生物防治和农业外来入侵生物防控技术，(E-mail)gwc1966@163.com

S435.112.6

A

1001-4330(2016)11-2069-08