新疆Kiyik废弃古河道天然胡杨林地可培养细菌的多样性研究

吐尔逊阿依·麦麦提依明，玛依古丽·库尔班，马丽艳木·阿木东，米尔班古丽·阿卜杜如苏力，努斯热提古丽·安外尔，艾克拜尔·木哈塔尔，祖丽皮亚·玉努斯，艾尔肯·热合曼

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)



新疆Kiyik废弃古河道天然胡杨林地可培养细菌的多样性研究

吐尔逊阿依·麦麦提依明，玛依古丽·库尔班，马丽艳木·阿木东，米尔班古丽·阿卜杜如苏力，努斯热提古丽·安外尔，艾克拜尔·木哈塔尔，祖丽皮亚·玉努斯，艾尔肯·热合曼

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

【目的】研究新疆塔里木河中游的Kiyik废弃古河道天然胡杨林地可培养细菌群落结构和多样性。【方法】从Kiyik废弃古河道胡杨林两个采样点(采样点I，采样点II)采集样品，采用LB、TSA和YPG等3种不同培养基分离纯化细菌，并对它们进行16 S rDNA测定和系统进化分析。【结果】108株菌来自于采样点I，85株菌来自于采样点II，共分离纯化了不同表型的193株菌。16 S rDNA序列分析结果表明193株菌分别属于5个大类群：厚壁菌门(Firmicutes)占59.6%，γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)占29.5%，放线菌门(Actinobacteria)占7.3%，β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)占2.6%， α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)占1.6%，26个属，62个种。其中有34株菌的16 S rDNA相似率﹤98.0%，分别属于11个属的25个物种，是胡杨林本源的潜在新菌种。假单孢菌属(Pseudomonas, 34.3%)是采样点I中分离到的优势细菌属，而采样点II的优势细菌属为芽孢杆菌属(Bacillus，54.1%)。芽孢杆菌属和微杆菌属(Microbacterium)是两个采样点共有的属，在物种水平上仅有芽孢杆菌属的4个物种为两个采样点共有，而其他菌种仅发现于单个样点。【结论】在两个采样位点中分离到的可培养细菌具有较高的多样性，两个样点菌种分布的差异极显著。存在的潜在新细菌菌种资源较丰富，具有进一步发掘的潜力。

Kiyik河；胡杨林；可培养细菌；16S rDNA；细菌多样性；群落结构

0 引 言

【研究意义】地球陆地表面约47.2%以上属于干旱气候的地区，该区域包括了降雨量稀少的极端干旱区和灌木林或疏林覆盖的半干旱区等各种干燥环境。胡杨(PopuluseuphraticaOliv.)分类学上属于杨柳科杨属，落叶乔木，生长在中纬度的干旱荒漠地区，具有抗寒、抗热、抗干旱、抗风沙、耐盐碱等优良性状，是新疆荒漠中分布最广的落叶树种，也是特有的荒漠森林树种[1]。塔里木河流域分布着全世界最大的一片天然胡杨林，其面积近30×104hm2[2]，它约占全国胡杨林总面积的90%和全世界胡杨林总面积的55%以上[3,4]，是极其珍贵的自然资源。微生物群落结构和多样性是微生物生态学和环境科学研究的热点内容，对开发微生物资源，阐明微生物群落与其生境的关系，揭示群落结构与功能的联系，了解微生物群落功能的定向调控具有重要意义[5]。【前人研究进展】包慧芳等[6]对塔克拉玛干沙漠腹地胡杨林土壤细菌多样性进行了研究，分离到27株菌并进行了酶活性分析。孜来古丽等[7]从塔河胡杨林样品中分离 22个菌株，发现其中有3个潜在的新种；玛丽艳木等[8]从沙雅县胡杨林土壤中分离了57株菌并进行了细菌多样性的分析；卡依尔等[9]对Ugan河胡杨可培养内生细菌的多样性进行了报道；程刚[10]采用免培养方法对尉犁县胡杨内生细菌的多样性进行了研究。何香等[11](2010)从沙雅县胡杨林土壤分离了一个新菌种Sphingobacteriumshayense，肖婷等[12](2013)从和田河胡杨林土壤中分离了新菌种Sphingobacteriumhotanense，麦孜拉木等[13](2014)从Ugan河胡杨林分离了一个新菌种Rhizobiumpopuli。上述研究采用可培养和免培养内生细菌方法来进行多样性分析以外，还对胡杨林潜在内生细菌进行多项分类学方法，不仅可以搞清楚胡杨内生细菌的群落结构，分离拯救一批不可多得的珍惜菌种和本源土著菌种，还可以为将来的科学研究提供菌株资源和数据。玛丽帕等[14]报道了(2013)从Kiyik河胡杨林土壤中分离的一个新菌种Rhizobiumtarimense；以及吾尔麦提汗等[15]2014年对塔里木胡杨林胡杨内生细菌的多样性与时空演变格局进行了报道，其中从Kiyik河胡杨内存液分离出隶属于6大类群，25个属，49个种的151株胡杨内生细菌，Pseudomonas(假单孢菌属)为优势属，并发现20个潜在新种。【本研究切入点】在国内外文献中，除了上述报道之外，针对Kiyik河胡杨林土壤可培养细菌资源尚未见系统地进行分离和用现代细菌分类学方法进行研究的报道。【拟解决的关键问题】阐明Kiyik河土壤细菌群落结构组成与其分布的信息，对比同一生态环境中的两个不同微生境的菌种群落组，为应用微生物新技术促进林业可持续发展奠定理论基础和提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究区自然概况

塔里木盆地特有暖温带极端干旱的大陆性气候，光热资源丰富，降水稀少，年均降水量为17.4～42 mm，而年蒸发量却高达1 890.1～3 229.3 mm，该地的胡杨林主要分布在海拔高度约为700～1 500 m塔里木河及其废弃古河道两岸泛洪区的狭长带区。在现在的塔河中游(沙雅县至尉犁县)主河道的南面，塔克拉玛干沙漠的北部边缘荒漠区，遗留着历史上由于塔河改道而干枯的6条较大的废弃古河道遗迹。其中分布在最南部废弃年代最久远的2条河道上，只剩下胡杨的残桩断枝，已没有活体胡杨的分布。在其余4条废弃河道沿岸，不同程度的分布着依靠地下水维系生命的衰败状态的胡杨林。废弃345年的Kiyik河[15]利用地下水无性繁殖的萌生林木的生长状况略好于其它废弃河道。Kiyik河与塔里木河主河道之间存在直线距离37.64 km以上的沙丘荒漠带，两个河道之间没有行车的道路。Kiyik河断流年代比较久远，完全脱离了塔河水系。因此，分布在Kiyik河流域胡杨林与其它河流域胡杨林之间早已失去了利用洪水散播种子的自然条件，丧失通过互换种子来维系相互之间的基因流畅通及借此传播内生菌的机制，形成了在时间和空间上相对隔离封闭的生态体系。采样位点I位于Kiyik古河道的中上游，离尉犁县喀尔曲卡乡47.16 km ，是典型的干旱、光照强、地下水位低的沙漠地区。位点II位于Kiyik古河道的中下游，离尉犁县喀尔曲卡乡37.64 km，该点地下水位较高，河床底部常年有少量地下水溢出，是周边野生动物饮用水的水源地，河床底部积水周边有较大面积的湿土分布，沙土盐浓度较高。图 1

1.2 材 料

1.2.1 样品采集

Kiyik废弃古河道两个采样点的GPS位点分别为样点I A: ( N 40°4244.3″ E 85° 0102″ )和样点II B：( N 40° 4120.0″ E 84° 5312.8″ )，两位点相距为11.69 km。每个样点各采取四份土样，采样深度为0～20 cm，各样品重量为250 g，将4点采集的土壤样品放置于一个样品袋中混匀，尽快带回实验室，放人4℃冰箱备用。图1

1.2.2 培养基

实验中采用溶菌肉汤培养基LB(胰蛋白胨10 g, 酵母浸粉5 g, 氯化钠10 g, 琼脂粉15～ 20 g, 蒸馏水1 000 mL, 调pH值至7.0～ 7.5) , 胰蛋白胨大豆琼脂培养基TSA(胰蛋白胨15 g, 大豆蛋白胨7.5 g, 氯化钠30 g, 琼脂粉15～20 g, 蒸馏水1 000 mL, 调pH值至7.0～ 7.5)，培养基YPG(蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸钙2 g，氯化钙0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂粉15～20 g，蒸馏水1 000 mL，调pH值至7.0～7.5)三种培养基。

注：(A: 采样点 I, B: 采样点 II)

Note：(A: Site I, B: Site II)

图 1 Kiyik 河上下游样点示意图
Fig.1 Study area at the up and down stream of the Kiyik River, Xinjiang

1.2.3 主要试剂和仪器

PHB-8型笔式pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)；TaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR产物纯化试剂盒由上海生工生物工程技术服务有限公司提供; PCR仪为ALD.1244型，购自BIO.RAD公司；凝胶成像分析仪ALPHAIMAGERTM2200及成像软件AlphaEase 4.1.0，购自AlphaInnotech公司；恒温振荡摇床和恒温培养箱购自江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 方 法

1.3.1 细菌的分离培养

把采来土壤样品，用置于冰浴的LB (溶菌肉汤培养基) 、TSA(胰蛋白胨大豆琼脂培养基)和YPG(乳糖复发酵培养基)稀释至10-1～10-6倍，取100 μL涂布到上述的三种固体培养基，分别在28～37℃培养3～7 d。根据细胞与菌落形态、颜色、大小分别挑取表型差异的细菌，并在上述的培养基上划线纯化，纯化后的内生细菌用含30%甘油的LB培养基于-70℃保存备用。

1.3.2 基因组DNA提取及16 S rDNA的扩增

DNA提取参照刘刚等[16]的方法进行。16 S rDNA扩增采用细菌通用引物[17]27F ( 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′) 和 1 492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′) 。PCR反应体系(50 μL): DNA模板约3.0 μL，10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol/L的P1和P2各1 μL，dNTP(10 mmol/L) 4 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，加灭菌双蒸水至50.0 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30个循环； 72℃ 10 min。反应结束后，取2～3 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR产物送到上海生物工程有限公司进行16 S rDNA完整长度测序。

1.3.3 系统发育分析

测序结果在EZTAXON( EzTaxon server 2 )和BLAST( http : // www. ncbi. nlm. nib. gov / blast /blast. cgi )上进行分析。用CLUSTAL _ X进行多序列比对[18]，系统进化矩阵根据Kimura模型估算[19]，用MEGA5.0 ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件采用邻接法(Neighbor. Joining)聚类分析，并构建出系统进化树[20]。

1.4 核酸序列注册号

在研究当中所获得的16 S rDNA基因序列已提交到Genbank数据库。注册号如(表1)所示。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化与测序

分别用LB、TSA和YPG等3种培养基进行稀释涂布法分离，选择表型不同的菌株进行划线法培养纯化。从样品中分离并成功对其16 S rDNA全序列测序(序列长度1 300～1 500 bp)的土壤细菌共193株，其中108株细菌分离自样点I，其他85株菌分离自样点II。它们分别属于5个大类群26个属，62个种。其中厚壁菌门的细菌占总分离菌的59.6%，γ-变形菌门占29.5%，放线菌门占7.3%, β-变形菌纲占2.6%, α-变形菌纲占1.6%。厚壁菌门的细菌是土壤中的优势类群，这与微生物所在的盐生环境是相应的。从土壤样品中共分离到了75株芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，分属于20个物种，芽孢杆菌属为土壤样品中的优势属(38.9%)。第二个优势属为假单孢菌属(Pseudomonas，19.2%)，37株该属的菌分属于5个物种。第三个优势属为动性杆菌属(Planomicrobium，10.4%)，20株该属的菌分属于4个物种。第四个优势属为海杆菌属(Marinobacter，7.8%)，该属的15株菌分属于4个物种。Bacillusalkalitelluris为优势菌种，占总分离菌株的8.3%。其次是Planomicrobiumalkanoclasticum占总分离菌株的6.2%。Pseudomonasargentinensis是第三位优势种，占总分离菌株的5.7%。与Bacillusalkalitelluris最近缘的16株菌的16 S rDNA相似率范围为96.56%～99.53%，与Planomicrobiumalkanoclasticum最近缘的12株菌的16 S rDNA相似率范围为97.383%～98.994%。与Pseudomonasargentinensis最近缘的11株菌的16 S rDNA相似率范围为97.14%～98.70%。16 S rDNA序列数据表明，与同一个物种最近缘的菌株的16 S rDNA序列上变异与分化程度较大，在同一个生态环境中长期演变的趋势比较明显。表1

表1 Kiyik 古河道胡杨林地可培养细菌的群落结构和16 S rDNA序列同源性
Table 1 Cultivable Bacterial Diversity in Natural Populus euphratica Forest Soils at the Dried-up, Ancient Kiyik River, and 16 S rDNA homology

代表菌株Representativeisolates属Genus最近亲缘菌株Closestspecies分离来源OriginofisolatesIIITotal同源性Homology(%)CM15(HQ699508)ArthrobacterArthrobacterscleromae(AF330692)1199220CM6(HQ699502)AcinetobacterAcinetobacterbouvetii(AF509827)1198414PT35(HQ234271)，BacillusBacillusaquimaris(AF483625)33698101～98342ML14(HQ234273)Bacillustequilensis(EU138487)54997637～100ML2(HQ234275)Bacillusmarisflavi(AF483624)1199354ML4(HQ234276)Bacillussafensis(AF234854)31499023～99512ML6(HQ234278)Bacillusinfantis(AY904032)1199707ML35(HQ234279)Bacillusfirmus(X60616)2298498～99218PL3(HQ234281)Bacillusniabensis(AY998119)71896692～98734PT45(HQ234283)Bacillushorneckiae(EU861362)2297279～97542PL24(HQ234284)Bacilluslitoralis(AY608605)1197037M8(HQ699513)Bacilluskorlensis(EU603328)4498129～98904DL19(HM854269)Bacillusalkalitelluris(AY829448)161696565～99527CT32(HM854262)Bacillusvietnamensis(AB099708)4497663～98080M14(HQ699515)Bacillusatrophaeus(AB021181)2299449～99543CL29(HM854261)Bacilluspumilus(ABRX01000007)2298841～99901M29(HQ699492)Bacillusaltitudinis(AJ831842)3399230～99721CT35(HM854263)Bacillusniacini(AB021194)4498619～99574M3(HQ699496)Bacillusberingensis(FJ889576)1197637M23da(HQ699499)Bacillusstratosphericus(AJ831841)2299106～99123DL15-3(HM854267)Bacillusforaminis(AJ717382)2296968～97168YS90(HQ111522)Bacillusoceanisediminis(GQ292772)1199611QL13(HQ234267)BrachybacteriumBrachybacteriumfaecium(ABTF01000003)1197759ML22(HQ234282)ExiguobacteriumExiguobacteriummexicanum(AM072764)1199282DT7-2(HM854271)GracilibacillusGracilibacillusureilyticus(EU709020)2298681DT14-1(HM854272)Gracilibacillussaliphilus(EU784646)2299792R5-14(HM448808)HerbaspirillumHerbaspirillumhuttiense(AB021366)11100CL17(HM854275)HalomonasHalomonaspacifica(L42616)1199706PL32(HM448811)IsoptericolaIsoptericolahalotolerans(AY789835)1198456CT28(HM854276)IdiomarinaIdiomarinadonghaiensis(EU600204)1197481CT34(HM854277)Idiomarinahomiensis(DQ342238)1197278

续表1

代表菌株Representativeisolates属Genus最近亲缘菌株Closestspecies分离来源OriginofisolatesIIITotal同源性Homology(%)M32(HQ699495)KocuriaKocuriarosea(X87756)1199712PY1(HQ234269)MicrobacteriumMicrobacteriummarinilacus(AB286020)1197787PT6(HQ326998)Microbacteriumginsengisoli(AB271048)2297691～9832PT19(HM448809)Microbacteriumhydrocarbonoxydans(AJ698726)1196395DT5(HQ326988)Microbacteriumpaludicola(AJ853909)1199009DT27(HQ009858)Microbacteriumaquimaris(AM778449)3399120～99218CL9(HM854280)MarinobacterMarinobacterflavimaris(AY517632)6698573～98849CT36(HQ326987)Marinobacterguineae(AM503093)1198429CT43-2(HQ009854)Marinobacterpelagius(DQ458821)2298279～99709CT42(HQ009855)Marinobacterlipolyticus(AY147906)6698561～98958DL20(HQ009859)MicrococcusMicrococcusterreus(FJ423763)11100DL27-1(HQ111518)OceanobacillusOceanobacilluspicturae(AJ315060)7798681～99889PT16(HM371422)PigmentiphagaPigmentiphagadaeguensis(EF100696)4497244～98578ML8(HM371423)PseudomonasPseudomonaspeli(AM114534)8897448～99497QL6(HM371425)Pseudomonasxanthomarina(AB176954)8896949～99249PT15(HM448810)Pseudomonasargentinensis(AY691188)111197143～98703PL31(HQ234264)Pseudomonasstutzeri(U26262)9999204～99221PT39(1)(HQ234265)Pseudomonasxinjiangensis(EU286805)1198848CM12(HQ699505)PlanococcusPlanococcusdonghaensis(EF079063)1198053QT3+ (HQ234280)PlanomicrobiumPlanomicrobiumalkanoclasticum(AF029364)3396747～99317QT3(HQ234277)Planomicrobiumglaciei(EU036220)2296955～99345QL24(HQ234274)Planomicrobiumokeanokoites(D55729)121297383～98994QT16(HQ234272)Planomicrobiumkoreense(AF144750)3398381～98441PL41(HM371420)RhizobiumRhizobiumhuautlense(AF025852)2297251～9734ML28(HM371421)RheinheimeraRheinheimeraaquimaris(EF076757)1197176CM10(HQ699504)RhodococcusRhodococcusqingshengii(DQ090961)1199509PL45(HQ234263)SkermanellaSkermanellaaerolata(DQ672568)1197931ML9(HQ234270)SporosarcinaSporosarcinaaquimarina(AF202056)2296667～98154ML41(HQ234268)Sporosarcinasaromensis(AB243859)2299316～99247QL7(HQ234266)StaphylococcusStaphylococcusequorumsubspEquorum(AB009939)1199045CT23(HQ111519)ThalassobacillusThalassobacillusdevorans(AJ717299)2299441～99581总计(total)：10885193

注：表中分离来源—列I代表Kiyik河中上游， 列II代表Kiyik河中下游，下同

Note：Origin of isolates in the table-column I represents Kiyik river Middle and upper reaches, column II represent middle and lower reaches of the Kiyik river

2.2 细菌的系统发育

2.2.1 采样点I土壤细菌多样性及系统发育

位点I获得108株细菌，通过16 S rDNA序列测序，EzBioCloud(EzTaxon server 2.1)和BLAST上比对序列相似性，确定菌株的系统发育地位，并构建系统发育树分析进化关系(图 2a)。结果表明，108株细菌分别属于厚壁菌门(Firmicutes51.9%)，γ-变形菌门(Gamma-proteobacteria35.2%), 放线菌门(Actinobacteria6.5%)，β-变形菌纲(Beta-proteobacteria4.6%)和α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria2.8%)等细菌域 5大系统发育类群，16个属，35个物种。其中厚壁菌门(Firmicutes)是优势类群，其次是γ-变形菌门(Gamma-proteobacteria)(图 2a)。其中假单孢菌属(Pseudomonas)作为优势属，占总分离菌株的34.3%，分离频率最高，分离到的 37 株该属的细菌，分别属于5个不同物种。其次是芽孢杆菌属(Bacillus)占总分离菌株的26.9%，分离到的29株该属的细菌，分别属于10个物种。动性微菌属(Planomicrobium)是第三个优势属，分离到的20株该属的细菌，分别属于4个物种。除了以上的出现频率较高的细菌以外，还分离到13个属的细菌：根瘤菌(Rhizobium；1个种，2个菌株)，Skermanella(1个种，1个菌株)，草螺菌属(Herbaspirillum；1个种, 1个菌株)，Pigmentiphaga(1个种，4个菌株)，Rheinheimera(1个种，1个菌株)，节细菌属(Arthrobacter；1个种, 1个菌株)，杆菌属(Brachybacterium；1个种，1个菌株)，白蚁菌属(Isoptericola；1个种，1个菌株)，微杆菌属(Microbacterium；3个种，4个菌株)，微小杆菌属(Exiguobacterium；1个种, 1个菌株)，动性球菌属(Planococcus；1个种，1个菌株)，Sporosarcina(2个种，4个菌株)，葡萄球菌属(Staphylococcus；1个种，1个菌株) 。表1，图2a

注：每个分支点上的数字为自展支持率，这个值 1000次重复自展试验后获得的。从研究序列以粗体显示，为序列括号内字符记号

Note：The numbers above each branch indicate bootstrap values of distance. The bootstrap values were obtained after a bootstrap test with 1,000 replications. Sequences from this study are shown in bold. GenBank accession numbers are given in parentheses.

图 2 Kiyik古河道样位点I (a) 和II (b)胡杨林土壤可培养细菌 16 S rDNA 系统发育

Fig. 2 Phylogenetic relationships among bacterial isolates from Site I (a) and Site II (b), based on the 16 S rDNA sequences.

2.2.2 采样点II土壤细菌多样性及系统发育

样点II中共获得了85株细菌，通过16 S rDNA基因序列测序，EzBioCloud(EzTaxon server 2.1)和BLAST上比对序列相似性，确定菌株的系统发育地位，并构建系统发育树分析进化关系(图 2b)。结果表明，85株细菌分别属于厚壁菌门(Firmicutes69.4%)，γ-变形菌纲 (Gamma-Proteobacteria22.4%)，放线菌门(Actinobacteria8.2% )等细菌域3大系统发育类群，12个属，31个物种。其中厚壁菌门(Firmicutes)是优势类群，其次是γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)(图 2:b)。芽孢杆菌属(Bacillus)作为优势属，占总分离菌株的54.1%，分离到46株该属的细菌，分别属于14个不同物种。 其次是海杆菌属(Marinobacter)，分离到15株该属的细菌，占总分离菌株的17.6%，分别属于4个物种。海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)占8.2%，分离到7株该属的细菌，只属于1个物种。除此之外还分离了不动杆菌属(Acinetobacter；1个种，1个菌株)，盐单孢菌属(Halomonas；1个种，1个菌株 )，Idiomarina( 2个种，2个菌株)，微杆菌属(Microbacterium；2个种，4个菌株)，微球菌属(Micrococcus；1个种，1个菌株)，库克菌属(Kocuria；1个种，1个菌株 )，红球菌属(Rhodococcus；1个种，1个菌株)，糖球菌属(Gracilibacillus；2个种，4个菌株)，Thalassobacillus(1个种，2个菌株) 。表 1，图2b

2.3 新菌种分布

Kiyik河胡杨林土壤细菌总共分离的193株细菌中，有34株菌与其已知的最近亲缘关系菌株的16 S rDNA序列相似性低于98.0%，占总分离菌株的17.62%。这34株菌隶属于11个属，25个物种，是25个潜在的新菌种，也是胡杨林地的特有本源土著菌种。这25个潜在新种中没有发现两个采样点共同出现的潜在新种，它们分别分布于Kiyik古河道2个样点的其中一个样点中，这表明样点I与样点II之间的土著菌种的差异极显著。其中样点I中出现的18个潜在新菌种，分别属于Bacillus，Brachybacterium，Microbacterium，Pigmentiphaga，Pseudomonas，Planomicrobium，Rhizobium，Rheinheimera，Skermanella，Sporosarcina等10个不同属。样点II的7个潜在新种，分别属于Bacillus与Idiomarina这两个属。二样点胡杨林区土壤细菌新菌种的检出频率表现出了较大的差异，样点I为18种，但样点II只有7种。表 2

2.4 两个采样位点细菌群落分布对比

以上结果显示Kiyik废弃古河道天然胡杨林地采样位点I和II之间的可培养细菌群落结构有明显的不同。样点I的105株菌分别属于5大类群，样点II的85株细菌分别属于3大类群，其中两个样位点共同出现的有γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)，放线菌门(Actinobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)。α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)和 β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)仅出现在样点I中。其中厚壁菌门是样点I和样点II的优势类群，分别占51.9%，69.4%。样点I分离的菌株分别属于16个属，其中假单孢菌属为优势属，占34.3%。样点II的菌株属于12个属，芽孢杆菌属为优势属，占54.1%。Arthrobacter，Brachybacterium，Exiguobacterium，Herbaspirillum，Isoptericola，Pigmentiphaga，Pseudomonas，Planococcus，Planomicrobium，Rhizobium，Rheinheimera，Skermanella，Sporosarcina，Staphylococcus等14个属仅出现在样点I中，而Acinetobacter，Gracilibacillus，Halomonas，Idiomarina，Kocuria，Marinobacter，Micrococcus，Oceanobacillus，Rhodococcus，Thalassobacillus等10个属仅在样点II中出现。在这两个采样点中共同存在的菌群只有芽孢杆菌属(Bacillus)和微杆菌属(Microbacterium)。样点I的优势种是属于厚壁菌门动性杆菌属的Planomicrobiumokeanokoites，占总分离菌株的11.4%。采样位点II的优势种是厚壁菌门芽孢杆菌属的Bacillusalkalitelluris，占总分离菌的18.8%。其中Bacillusaquimaris，Bacillustequilensis，Bacillussafensis，Bacillusniabensis是两个样点共同出现的4个菌种 。其他58个菌种仅发现在单个样点。样点I的63株菌是革兰氏阳性菌，42株菌是革兰氏阴性菌，样点II的66株菌为革兰氏阳性菌，19株菌是革兰氏阴性菌。样点I与样点II的微生物群落的结构和多样性的不同，主要是其分布的微环境的不同所引起的。表 1，表 2，图 2，图 3

表 2 潜在新种的16 S rDNA序列相似性
Table 2 16 S rDNA similarity of potential new species and its closest relative specie

属Genus最近亲缘菌株Closestspecies分离来源OriginofisolatesIIITotal16SrDNA序列相似率Similarity(%)1BacillusBacillustequilensis(EU138487)11976372Bacillusniabensis(AY998119)11966923Bacillushorneckiae(EU861362)2297279～975424Bacilluslitoralis(AY608605)11970375Bacillusalkalitelluris(AY829448)6696565～972956Bacillusvietnamensis(AB099708)2297663～978697Bacillusberingensis(FJ889576)11976378Bacillusforaminis(AJ717382)2296968～971689BrachybacteriumBrachybacteriumfaecium(ABTF01000003)119775910IdiomarinaIdiomarinadonghaiensis(EU600204)119748111Idiomarinahomiensis(DQ342238)119727812MicrobacteriumMicrobacteriummarinilacus(AB286020)119778713Microbacteriumginsengisoli(AB271048)119769114Microbacteriumhydrocarbonoxydans(AJ698726)119639515PigmentiphagaPigmentiphagadaeguensis(EF100696)119724416PseudomonasPseudomonaspeli(AM114534)119744817Pseudomonasxanthomarina(AB176954)119694918Pseudomonasargentinensis(AY691188)119714319PlanomicrobiumPlanomicrobiumalkanoclasticum(AF029364)119674720Planomicrobiumglaciei(EU036220)119695521Planomicrobiumokeanokoites(D55729)119738322RhizobiumRhizobiumhuautlense(AF025852)2297251～9734023RheinheimeraRheinheimeraaquimaris(EF076757)119717624SkermanellaSkermanellaaerolata(DQ672568)119793125SporosarcinaSporosarcinaaquimarina(AF202056)1196667计，total：1125(I：18，II：7)201434<9800%

注：(a: 厚壁菌门, b: 放线菌门 c：γ-变形菌门, d：β -变形菌纲, e：α-变形菌纲)

Note：(a:Firmicutes, b:Actinobacteria, c:Gamma-proteobacteria, d:Beta-proteobacteria, e：Alpha-proteobacteria)

图3 16 S rDNA序列分析来比较位点 I 和位点 II的细菌分布
Fig. 3 Comparison of bacterial distribution by 16 S rDNA sequence analysis of bacteriaat Site I and Site II

2.5 菌种与潜在新菌种检出率

研究从Kiyik河样点I中分离到了108株土壤菌株，它们隶属于5大系统发育类群，16个属，35个物种。平均每 3.085(108/35)个分离菌株产生1个物种水平的分类学单元。在样点I中分离到18种潜在新菌种，平均每6(108/18)个分离株能够检出1个潜在的新物种分类单元。

从样点II中分离到了85株菌株，它们隶属于3大系统发育类群，12个属，31个物种。平均每2.741(85/31)个分离菌株产生1个物种水平的分类学单元。样点II中分离到7种潜在新菌种，平均每12.14(85/7)个分离株就能够检出1个潜在的新物种分类单元。 表3

数据表明，样点II的菌种检出率高于样点I。但样点I的潜在新菌种检出率高于样点II，这说明动物携带的突变体品系进入样点I胡杨林土壤的机遇较少，形成改变原有平衡状态的外来优势种群比较有限，细菌群落结构没有发生太大的变化，相当程度上保持了原始状态。

Kiyik古河道土壤样品中共分离到了193株细菌，它们隶属于5大系统发育类群，26个属62个物种。平均每3.113(193/62)个分离菌株产生1个物种水平的分类学单元。其中分离到25个潜在新菌种，平均每7.720(193/25)个分离株能够检出1个潜在的新物种分类单元。Kiyik河土壤可培养细菌与可培养内生细菌的菌种检出率和潜在新菌种检出率结果[15]。表 2，表3

表 3 Kiyik河胡杨林细菌菌种与潜在新菌种检出率
Table 3 The detection rates of bacteria species number and the Indigenous potential new species number of Populus euphratica forest in Kiyik river

检出率Detectionrates样点ISiteI样点IISiteIIKiyik河流域土壤可培养细菌检出率Kiyik河流域胡杨可培养内生细菌的检出率[15]Totaldetectionrates菌种bacteriaspecies1/30851/27411/31131/3082潜在新菌种Potentialnewspecies1/61/12141/77201/7550

3 讨 论

3.1 塔里木河流域分布着全世界最大的一片天然胡杨林，其面积近30×104hm2[3]，在这里生栖着150余种植物和200多种动物[21]，构成独特的天然干旱荒漠型生态系统。研究所选取的样点Kiyik河流域没有人类建造的房屋，牲畜的圈棚和水井的遗迹，是未受人类活动影响的净土。

3.2 胡杨内生细菌多样性高，整体上在门和纲、属和物种的水平上都展现了其内在的丰富度。 在193株分菌株中厚壁菌门(Firmicutes)为整个Kiyik河流域天然胡杨林土壤主要的优势类群，芽孢杆菌属(Bacillus)为主要的优势细菌属。这一点与胡杨林区其他区段土壤环境中所得到的研究结果一致[22]。产芽孢细菌在极端环境条件下，具有比较强的适应和生存能力的特性决定了这类细菌的优势度[23-25]。分离到的193株菌中革兰氏阳性细菌为129株，占66.8%，革兰氏阴性菌为64株，占33.2%, 属于革兰氏阳性菌的厚壁菌门耐旱特性都比较强，对气温的变化有广域的适应能力。因此，在干旱沙土环境中，生存和繁衍面临的局限性条件比较有限，能够高效地降解和利用矿物质。

3.3 在这193株菌种中，许多分离的菌株仅出现在两个采样位点的一个样点上，在属的水平上只有Bacillus属和Microbacterium属都能从这两个样点可发现。在菌种的水平上，仅有4个菌种为两个样点的共有物种，其他58个菌种仅分别发现于单一的样点。两个样点的个性大于共性。属于裸露状态的河岸胡杨林沙土层比较易于受到外界环境因素的影响，强日照、低温、盐碱度、降雨量以及沙尘暴等自然力都可以直接影响沙土层不同微生物的生长条件和繁殖速率，导致细菌群落结构的改变。这表明同一个生态体系中两个微环境样点土壤的理化特性差异很大，两个样点细菌群落结构产生了极显著的变迁。

3.4 通过对分离的193株细菌16 S rDNA序列同源性比对分析发现，34株菌与其系统发育关系最密切的模式菌株的16 S rDNA基因相似率均低于98.00%，是Kiyik河胡杨林土壤细菌的特有本源菌群。本源潜在新菌种是一个细菌群落中特有的物种，因为它不存在于其它任何不同的细菌群落中。因而本源潜在新菌种数量的多少可以直观的反映一个微生物群落是否处于原生态状态。潜在新菌种数量多表明外来优势常见菌种尚未对它们进行取代和替换，反之则表明潜在新菌种被外来优势常见菌种清除、数量减少，细菌群落结构发生了改变[15]。同理，随着外来优势常见菌种的持续入侵，群落中原有弱势菌种不断被取代清除，导致菌种数减少。所以一个细菌群落是否被外源菌群入侵，也可以通过该群落的菌种数量作为指标进行衡量和判定[15]。对Kiyik河胡杨林土壤潜在新菌种进行分类学鉴定，可为胡杨林生态系统的保育及改善、维护胡杨林生态安全，开发胡杨林微生物资源具有一定的应用前景。

3.5 采样点土壤理化性质的不同是两个样点可培养细菌群落差异显著的主要原因。样点I地下水位低，是个极其干燥，多沙的环境地段。该河道与塔河及其它废弃古河道之间，由于存在着大面积的沙丘形成空间隔离，几乎不可能受到外来物种影响，细菌多样性相当高。样点II河床底部常有少量的地下水溢出，底部积水周边有较大面积的湿土分布，是含盐较高的潮湿土壤。样点II是该生态体系野生动物的饮水地，某种程度上动物作为细菌的运输者导致该生态体系中其它地点的一些外来优势常见种群的入侵、定植和扩散。使有些本源土著菌种逐渐消失，潜在新菌种检出率明显降低。整体而言，Kiyik河的土壤细菌群落结构保持的极为完善，很少受到外界的影响，原生态保持状况与该河道胡杨内生细菌非常接近，这一点在菌种检出率与新菌种检出率数据上表现出高度的相似性。 表 3

3.6 胡杨是胡杨内生细菌相互作用的微生态环境，胡杨内生菌在胡杨的生理生化、物质代谢、免疫等方面起着举足轻重的作用，它们是胡杨病虫害生防菌株的有力候选菌株。土壤微生物是土壤的重要组成部分，是生态系统的分解者，它积极参与森林生态系统中物质循环和能量流动，在维持生态系统的结构与功能方面起着十分重要的作用[26]。吾尔麦提汗等[15](2014)对Kiyik河胡杨内生细菌的的研究与此次Kiyik河胡杨林土壤可培养细菌研究相比结果表明，有些菌种不管在胡杨土壤微生物群落，或在胡杨内生菌群落中均可发现。胡杨林土壤细菌群落与胡杨内生细菌群落显示较高的共同性，这与两个土壤样点的细菌群落结构形成明显的反差。由于相对而言，胡杨树内环境不易于被外界环境的改变所干扰，胡杨内生细菌群落结构比较稳定。基于植物与细菌的选择性共生关系，无适者生存能力的菌株被胡杨选择性的拒之体外，由同类物种的外来突变体品系在胡杨体内定植类型较少，形成改变原有平衡状态的外来优势种群比较有限。

3.7 研究吾尔麦提汗等[15]对Kiyik河胡杨内生细菌的的研究与差异性，大量出现在Kiyik河胡杨内存液的胡杨内生细菌Bacilluspumilus,Bacillussafensis,Brenneriasalicis,Pseudomonassabulinigri,Pseudomonasxinjiangensis,Rhizobiumrosettiformans, 并没有出现在胡杨林土壤样品中。Kiyik河胡杨内生细菌多样性的研究所分离的151株菌株中革兰氏阳性细菌有35株，占23.2%。革兰氏阴性的细菌有116株占76.8% 。Kiyik河胡杨林土壤中所分离的193株菌株内革兰氏阳性细菌为129株，占66.8%，革兰氏阴性菌为64株，占33.2%，两种生境的革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌比例形成明显的反差。这表明胡杨内生细菌与胡杨林土壤细菌的群落结构的组成及其多样性是胡杨内生环境和土壤环境条件自然选择的结果，有明显的微环境依存性。

3.8 本源潜在新菌种检出率是指本源的潜在新菌种数在所属群落的分离菌株数中所占的比率。菌种检出率是指一个群落中的所有菌种数在所属群落的分离菌株数中所占的比率。这两个指数越大就证明群落结构的原始状态保持的越好，反之就表明群落结构遭到了外来优势物种的更改。总体来说，Kiyik河胡杨可培养内生细菌与Kiyik河胡杨林土壤可培养细菌的菌种检出率和潜在新种检出率之间的差异不大，均处于较高的状态。

4 结 论

极端微生物具有独特的生理机制、基因类型和代谢产物是一类极具开发潜力的生物资源。采用可培养法对新疆Kiyik废弃古河道天然胡杨林地细菌多样性的研究结果表明，kiyik废弃古河道天然胡杨林独特的生态系统蕴藏着丰富的细菌种质资源，整个群落结构保持了较高的纯洁性，较少的受到外来优势菌群的入侵与取代，原始状态保持完好，与胡杨林这一大生态环境保持了较高的一致性。为极端环境中细菌的分离培养和开发利用奠定了基础。

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Fund project:Supported by the NSFC (U1203101) and (31060002) and science and technology Xinjiang supporting program of Xinjiang Uygur Autonomous Region (201091236)

Cultivable Bacterial Diversity in Natural Populus euphratica Forest Soils at the Dried-up, Ancient Kiyik River, Xinjiang, China

Tursunay Mamtimin，Marygul Kurban，Maryam Hamdun，Mihribangul Abdurusul，Nusratgul Anwar，Akbar Muhtar，Zulfiya Yunus，Erkin Rahman

(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

【Objective】 In order to understand the diversity and composition of forest soil bacterial communities from two different sites of ancient Kiyik River at the middle reaches of the Tarim River, Xinjiang, China. 【Method】Bacterial strains were isolated from the soil in two different sites (site I and site II) ofPopuluseuphraticaforest by three different types of culture media (LB, TSA, and YPG). They were examined by using 16 S ribosomal DNA sequence analysis. 【Result】The 108 strains were isolated from the sample site I, and the 85 strains were isolated from the sample site II, a total of 193 bacteria with different colony characteristics were isolated. Phylogenetic analysis based on 16 S rDNA gene sequence demonstrated that the 193 isolates belonged toFirmicutes(59.6%),Gamma-proteobacteria(29.5%),Actinobacteria(7.3%),Beta-proteobacteria(2.6%) andAlpha-proteobacteria(1.6%), encompassing 26 genera and 62 species. Of those isolates, the 16 S rDNA gene sequences of 34 strains were﹤98% and similar to 25 species within 11 genera that could be represented as potentially novel indigenous. The most common genus at site I wasPseudomonas(34.3%), while the most common genus at site II wasBacillus(54.1%).BacillusandMicrobacteriumspecies were found at both sampling sites. At the species level, only four species were common for two sampling sites which belonged to theBacillus. Whereas the rest isolates were found at only a single site. There were significant differences at distribution of strains from two sample sites.【Conclusion】The population diversity of cultivable bacteria varies widely in the study area and there were clear differences between the bacterial communities at the two sites sampled. There was abundant resource of potential novel species in this study, which has the potential for further research.

Kiyik River;Populuseuphraticaforest; cultivable bacteria; 16 S rDNA; diversity; community structure

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.05.019

2015-10-29

国家自然科学基金项目(U1203101)；国家自然科学基金项目(31060002)；新疆维吾尔自治区科技支疆项目(201091236)

吐尔逊阿依.麦麦提依明(1990-)，女，新疆人，硕士研究生，研究方向为资源微生物学，(E-mail)tursunay11@sina.com

艾尔肯.热合曼(1953-)，男，新疆人，教授，研究方向为资源微生物学，(E-mail)erkin1106@163.com

S188

A

1001-4330(2016)05-0921-14