IL-17/NF-κBp65信号通路在老年急性脑出血发病及组织损伤中的机制研究*

祁科乐， 季新忠△， 蒯 涛， 潘东峰， 贾咏存， 王 伟

宁夏回族自治区人民医院 1急诊科，2神经外科，3检验科，银川 7500014温州医科大学附属第一医院创伤外科，温州 325000



IL-17/NF-κBp65信号通路在老年急性脑出血发病及组织损伤中的机制研究*

祁科乐1， 季新忠1△， 蒯 涛2， 潘东峰1， 贾咏存3， 王 伟4

宁夏回族自治区人民医院1急诊科，2神经外科，3检验科，银川 7500014温州医科大学附属第一医院创伤外科，温州 325000

目的 探讨IL-17/NF-κBp65信号通路在老年患者急性脑出血发病及组织损伤中的作用。方法 选择2012年7月至2015年7月宁夏回族自治区人民医院收治的58例急性脑出血老年患者作为脑出血(ICH组)，按照发病至手术时间分为<6 h组(18例)，6 h～组(14例)，25 h～组(10例)，49 h～组(10例)和>72 h组(6例)，ICH患者均行开颅血肿清除术；另选择同期医院行第三脑室造瘘术的12例阻塞性脑积水患者作为对照组。两组患者术中取病灶周围脑组织，免疫组化染色检查IL-17、NF-κBp65阳性表达情况，免疫印迹法检测IL-17、NF-κBp65蛋白表达，实时定量RT-PCR检测IL-17、NF-κBp65 mRNA表达。结果 NF-κBp65主要在细胞核中表达，IL-17主要在细胞质中表达；对照组胶质细胞和神经元细胞少见IL-17、NF-κBp65表达，ICH组胶质细胞和神经元细胞可见大量IL-17、NF-κBp65表达，脑出血后随着时间的延长，IL-17、NF-κBp65阳性细胞数量呈先上升后降低趋势。ICH各组IL-17、NF-κBp65蛋白及mRNA表达水平均显著高于对照组(均P<0.05)；其中6 h～组IL-17蛋白及mRNA表达最高，分别为(0.81±0.11)和(0.83±0.13)；25 h～组NF-κBp65蛋白及mRNA表达最高，分别为(0.77±0.12)和(0.81±0.11)。结论 IL-17/NF-κBp65信号通路参与调节老年急性脑出血后炎症反应，提示调控IL-17/NF-κBp65信号通路可能缓解急性脑出血后脑组织损伤。

核因子κB； 白细胞介素-17； 信号通路； 急性脑出血； 炎症反应

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是临床上常见的急症，其死亡率高达50%以上[1]；在存活的患者中，约有70%存在不可逆的神经功能缺失[2]，给患者的健康带来极大威胁。ICH的发病机制非常复杂，其中炎性反应在ICH进展中发挥着重要作用。国外研究证实ICH后6～8 h脑组织周围出现炎性浸润，至48～72 h炎性反应达高峰，并诱导神经细胞发生凋亡、脑水肿等继发性损害[3]。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是生物界内存在的一种多功能核转录因子[4]，当机体发生应激性反应时，NF-κB被激活并转移至核内，参与调控炎性反应。病理学研究证实，NF-κB广泛存在于神经元细胞、脑胶质细胞和脑血管内皮细胞，并参与脑出血后的一系列应激反应[5]。白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)是在自身免疫性疾病、炎症反应中起关键作用的细胞因子，目前研究证实IL-17主要参与调节下游靶基因NF-κB的表达而介导机体的炎性反应[6]。本研究收集了58例老年ICH患者血肿周围组织样本，分析IL-17、NF-κBp65的时间表达规律，旨在探讨IL-17/NF-κBp65信号通路在老年ICH组织损伤中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经医院伦理委员会审核批准，选择2012年7月至2015年7月宁夏回族自治区人民医院收治的58例ICH患者作为ICH组，其中男34例，女24例，年龄65～84岁，平均(75.8±7.4)岁。58例ICH组患者按照发病至手术时间分为<6 h组(18例)，6 h～组(14例)，25 h～组(10例)，49 h～组(10例)和>72 h组(6例)。纳入标准：①血肿部位位于基底节区，血肿量30～70 mL；②所有患者均行开颅血肿清除术；③术前格拉斯哥昏迷评分[7](Glasgow Coma Scale，GCS)4～14分；④取得患者家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①近1个月内有炎症反应、外伤或出血史；②心、肝、肾等重要脏器病变；③合并恶性肿瘤者；④近1个月内服用免疫抑制剂、抗凝药等。另选择同期医院行第三脑室造瘘术的12例阻塞性脑积水患者作为对照组，男8例，女4例，年龄67～81岁，平均(75.6±6.9)岁；对照组均排除脑出血、全身炎症反应、自身免疫性疾病、严重脏器疾病或恶性肿瘤者。ICH组与对照组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 ICH组、对照组患者均于术中取病灶周围脑组织，标本取出后分为2份，其中一份采用10%甲醛固定，用于苏木精-伊红染色及免疫组化染色；另一部分立即置于液氮中保存，用于检测相关蛋白、mRNA表达。

1.2.2 免疫组化染色检查 取甲醛固定的组织切片，常规脱蜡，二甲苯及乙醇梯度洗脱；加入EDTA修复液，微波中修复抗原。切片PBS冲洗3次，加入2滴过氧化氢(3%)，室温孵育10 min；再滴加山羊封闭血清，分别加入IL-17、NF-κBp65多克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜；再滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育20 min。DAB显色、苏木精复染，自来水冲洗3次，再将切片乙醇梯度洗脱，自然晾干后树脂封片。将切片置于显微镜下观察，随机选择5个视野，计算细胞核NF-κBp65和细胞质IL-17表达阳性细胞所占百分比，计算5个视野的平均值。

1.2.3 IL-17、NF-κBp65蛋白检测 由于IL-17存在于细胞质、NF-κBp65存在于细胞核，因此提取方法存在一定差异，简述如下：将保存于液氮的组织样本取出，切成重约50 mg的小块，置于离心管中离心5 min，弃去上清液。向沉淀中加入胞质蛋白抽提试剂Ⅰ(CERⅠ)，充分振荡20 s，待沉淀细胞完全悬浮后，冰浴上孵育20 min；再向细胞悬液中加入CERⅡ，冰上孵育2 min，冷冻离心机25 000 r/min离心10 min，分离上清液和沉淀，上清液中含有胞质提取物。再向沉淀中加入核蛋白抽提试剂(NER)，冰上悬浮后充分振荡，再置于冰上孵育40 min，冷冻离心机25 000 r/min离心10 min，吸取上清液，上清液含有细胞核提取物。将提取的胞质蛋白和核蛋白采用BCA法进行蛋白定量。分别取50 μg胞质蛋白和核蛋白进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，半干法将电泳段转移至PVDF膜上；电转后取出PVDF膜，37℃下5%脱脂牛奶封闭2 h，PBS冲洗3次，加入1：300稀释的兔抗人IL-17多克隆抗体(核蛋白为1：1 000稀释的兔抗人NF-κBp65多克隆抗体)，室温孵育1 h，4℃过夜；PBS冲洗3次；再加入1：3 000稀释的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗，室温下振摇1 h，PBS冲洗3次。Odyssey成像系统分析条带灰度值，以目的条带与β-actin条带灰度值之比作为目的蛋白相对表达量。

1.2.4 IL-17、NF-κBp65 mRNA检测 将样本组织剪碎后充分研磨，在匀浆器中加入GIT变性液，待充分变性后吹打裂解细胞；按照Trizol提取试剂盒说明书提取总RNA，参考PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书反转录成cDNA，再将cDNA进行PCR实验，引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成，各引物序列见表1。PCR反应体系：双蒸水8.5 μL、DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL，cDNA 3 μL、Taq酶12.5 μL，总反应体系28 μL。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环后72℃延伸5 min。将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳(100 V，60 min)，采用凝胶成像系统进行分析，以β-actin为内参照，计算IL-17、NF-κBp65 mRNA与β-actin吸光度比值；共计测量3次，取3次平均值。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

NF-κBp65主要在细胞核中表达，IL-17主要在细胞质中表达；对照组胶质细胞和神经元细胞少见IL-17、NF-κBp65表达，ICH组胶质细胞和神经元细胞可见大量IL-17、NF-κBp65表达(图1、2)；出血后随着时间的延长，IL-17、NF-κBp65阳性细胞数量呈先上升后降低趋势，其中6 h～组IL-17细胞所占百分比[(62.4±9.3)%]显著高于<6 h组[(31.7±5.1)%]、25 h～组[(54.9±7.8)%]、49 h～组[(43.6±6.7)%]和>72 h组[(39.5.7±5.7)%]；25 h～组NF-κBp65阳性细胞数[(57.5±6.9)%]显著高于<6 h组[(24.6±3.5)%]、6 h～组[(50.3±6.1)%]、49 h～组[(43.1±4.7)%]和>72 h组[(37.4±4.2)%](均P<0.05)。

2.2 各组脑组织IL-17、NF-κBp65 mRNA表达水平

<6 h组、6 h～组、25 h～组、49 h～组和>72 h组IL-17、NF-κBp65 mRNA相对表达量分别为(0.56±0.07)、(0.62±0.10)，(0.83±0.13)、(0.76±0.09)，(0.79±0.10)、(0.81±0.11)，(0.77±0.06)、(0.79±0.14)，(0.62±0.04)、(0.65±0.07)均显著高于对照组[(0.09±0.02)、(0.14±0.05)](均P<0.05)，6 h～组IL-17 mRNA表达高于<6 h组、25 h～组、49 h～组和>72 h组，25 h～组NF-κBp65 mRNA表达高于<6 h组、6 h～组、49 h～组和>72 h组，见图3。

A：ICH组；B：对照组；黑色箭头所指为IL-17阳性细胞所在位置图1 ICH组和对照组细胞质IL-17表达(×200)Fig.1 IL-17 expression in ICH group and control group(×200)

A：ICH组；B：对照组；黑色箭头所指为NF-κBp65阳性细胞所在位置图2 ICH组和对照组细胞核NF-κBp65表达(×200)Fig.2 NF-κBp65 expression in ICH group and control group(×200)

M：Marker；1：<6 h组；2：6 h～组；3：25 h～组；4：49 h～组；5：>72 h组；6：对照组；与对照组比较，*P<0.05图3 各组脑组织IL-17、NF-κBp65 mRNA表达Fig.3 Expression of IL-17 and NF-κBp65 mRNA in brain tissues of each group

2.3 各组脑组织IL-17、NF-κBp65蛋白表达水平

<6 h组、6 h～组、25 h～组、49 h～组和>72 h组IL-17、NF-κBp65蛋白相对表达量分别为(0.57±0.09)、(0.52±0.06)，(0.81±0.11)、(0.63±0.06)，(0.62±0.09)、(0.77±0.12)，(0.58±0.07)、(0.63±0.11)，(0.48±0.02)、(0.50±0.07)，均显著高于对照组[(0.08±0.01)、(0.07±0.02)](均P<0.05)，6 h～组IL-17蛋白表达高于<6 h组、25 h～组、49 h～组和>72 h组，25 h～组NF-κBp65蛋白表达高于<6 h组、6 h～组、49 h～组和>72 h组(均P<0.05)，见图4。

与对照组比较，*P<0.05 图4 各组脑组织IL-17、NF-κBp65蛋白表达Fig.4 Protein expression of IL-17 and NF-κBp65 in brain tissues of each group

3 讨论

继发性脑损伤是指脑出血发生后，脑组织发生的炎性反应、自由基损伤等，导致神经功能持续减退。国外研究证实，在脑出血周围组织存在进行性损伤的脑水肿带，此区域神经元细胞损伤是可逆的，亦即在脑出血后的一定时间内给予积极的处理，部分神经组织功能能够恢复[8-9]。病理学研究证实，炎性因子介导的炎症反应是脑出血组织损伤的主要诱因，炎性细胞在出血等诱导下，趋化进入脑组织，并释放一些炎症因子，共同介导脑组织损伤和加重局部血肿占位效应[10]。韩冰冰等[11]报道称，发生脑出血后，在血肿周围脑组织可见大量白细胞浸润，随着时间的延长，白细胞和中性粒细胞浸润不断加深，至出血后第3天，血肿周围组织炎性细胞达高峰，此后逐渐降低。因此在炎症因子分泌达高峰前，阻断介导炎性反应的信号通路，能够显著缓解因炎性反应介导的脑组织损伤。

NF-κB是广泛存在于中枢神经系统的核蛋白因子。临床研究证实，脑出血后，NF-κB被激活，并介导一系列下游靶基因的表达[12]。激活NF-κB的因素较多，杨莎莎等[13]称脑出血所形成的血凝块会释放大量凝血酶，而凝血酶亦是NF-κB的激动剂。近年来有学者称IL-1β、肿瘤坏死因子-α等前炎症因子也会激活NF-κB，激活的NF-κB又会促进IL-6、CRP等炎症因子的释放，进而形成正反馈通路，导致局部血肿炎症反应加重[14]。李月红等[15]对脑出血大鼠模型进行观察，结果显示脑出血后8～72 h，血肿NF-κB持续升高，此后逐渐降低，但至出血后5 d，血肿组织NF-κB水平依然显著高于正常大鼠。IL-17是重要的细胞因子，在全身组织均有表达，其中中枢神经系统含量最高。Capitán-Caadas等[16]报道称IL-17主要在星形胶质细胞和小胶质细胞胞质中合成，正常情况下表达量极低；当细菌感染、脑出血、脑外伤等刺激下能够激活Caspase-1，将无活性的IL-17前体裂解成活性形式的IL-17，进而介导相应的炎症反应。本研究显示NF-κBp65主要在细胞核中表达，IL-17主要在细胞质中表达，这与马莉等[17]报道结论一致，说明NF-κBp65主要通过转移至核内发挥作用。另外ICH组胶质细胞和神经元细胞可见大量IL-17、NF-κBp65表达，对照组胶质细胞和神经元细胞少见IL-17、NF-κBp65表达，说明脑出血后血肿出现炎症反应，进而介导脑组织的损伤。

国外研究证实，IL-17是炎症反应启动因子，当IL-17与其受体IL-17R结合后，会激活NF-κB、JAKs/STATs等信号转导通路，介导一系列炎症反应[18]。毕胜等[19]向大鼠脑组织中注入IL-17，结果显示注射4 h后血脑屏障通透性逐渐增加，至第8 h达到高峰，72 h后血脑屏障通透性恢复正常，提示炎性反应对脑组织的损伤呈先增加后降低的趋势。本研究显示6 h～组IL-17蛋白及mRNA表达高于其他时段组，25 h～组NF-κBp65蛋白及mRNA表达高于其他时段组，说明IL-17在脑出血后6～24 h表达至高峰，此后逐渐降低；而NF-κBp65在脑出血后25～48 h表达至高峰，此后逐渐降低。Zhu等[20]报道称IL-17与特异性跨膜受体IL-17R结合，IL-17R空间构型发生变化，并激活NF-κB激酶NIK；而NIK能够降解IκB-α，使受到抑制的NF-κB大量释放并移位至核内，诱导下游IL-1、TNF-α等基因的转录，局部炎性反应也随之增强。而NF-κBp65表达水平与IL-17并不完全同步，推测可能是因为IL-17是上游基因，当IL-17表达至一定水平后才能诱导下游NF-κBp65基因表达[21-22]。

综上所述，IL-17/NF-κBp65信号通路参与调节老年急性脑出血后炎症反应，调控IL-17/NF-κBp65信号通路能够缓解急性脑出血后组织损伤，这将为脑出血的防治提供新的方向。

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(2016-06-12 收稿)

Mechanism of IL-17/NF-κBp65 Signaling Pathway in Acute Cerebral Hemorrhage in Elderly Patients

Qi Kele1，Ji Xinzhong1△，Kuai Tao2et al

1Department of Emergency，2Department of Neurosurgery，People’s Hospital of NingxiaHuiAutonomousRegion，Yinchuan750001，China

Objective To explore the mechanism of IL-17/NF-κBp65 signaling pathway in acute cerebral hemorrhage in elderly patients.Methods A total of 58 elderly patients with acute cerebral hemorrhage who were treated in People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region from July 2012 to July 2015 were enrolled as intracerebral hemorrhage(ICH)group in the study.They were divided into 5 groups according to the time duration from the onset of the disease to operation：less than 6 h group(n=18)，more than 6 h group(n=14)，more than 25 h group(n=10)，more than 49 h group(n=10)and more than 72 h group(n=6).ICH patients underwent craniotomy for evacuation of hematoma.Another 12 patients with obstructive hydrocephalus who underwent endoscopic third ventriculostomy served as control group.The brain tissues around the lesion were obtained during the operation.The positive expression of IL-17 and NF-κBp65 was detected by immunohistochemical staining and the protein levels by Western blotting.The mRNA expression of IL-17 and NF-κBp65 was detected by real-time quantitative RT-PCR.Results NF-κBp65 was mainly expressed in the nucleus，and IL-17 in the cytoplasm.They were rarely expressed in glial cells and neurons in control group and were robustly expressed in ICH group.The number of IL-17-positive and NF-κB p65-positive cells was initially increased and then decreased with the extension of hemorrhage.The expression levels of IL-17 and NF-κBp65 protein and mRNA were significantly higher in each experimental group than those in the control group(allP<0.05).The expression levels of IL-17 protein and mRNA were highest in more than 6 h group[(0.81±0.11)and(0.83±0.13)respectively]，and those of NF-κBp65 protein and mRNA were highest in more than 25 h group[(0.77±0.12)and(0.81±0.11)respectively].Conclusion IL-17/NF-κBp65 signaling pathway participates in the regulation of inflammatory responses after acute cerebral hemorrhage，which indicates that regulation of IL-17/NF-κBp65 signaling pathway may alleviate tissue damage caused by acute cerebral hemorrhage.

nuclear factor-κB； interleukin-17； signal pathway； acute cerebral hemorrhage； inflammatory reaction

*国家自然科学基金资助项目(No.81160043)

R743.34

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.007

祁科乐，男，1976年生，硕士研究生，主治医师，E-mail：124615389@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：13309591613@163.com