野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响

李　戈，李俊玫，葛志华，杨　宁， 杨佳宁

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响

李戈，李俊玫△，葛志华，杨宁， 杨佳宁

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

目的：观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响。方法：体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞分为对照组、不同浓度野黄芩苷药物组，野黄芩苷组分别用80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h。采用免疫细胞化学法观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响。结果：用药组Tca8113细胞Fas和FasL的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）；并且随着野黄芩苷药物浓度的增加，Fas和FasL的表达水平逐渐升高（P＜0.05）。结论：野黄芩苷可能通过促进人舌鳞癌Tca8113细胞Fas蛋白和FasL蛋白的表达促进肿瘤细胞凋亡。

野黄芩苷；人舌鳞癌Tca8113细胞；Fas；FasL

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，恶性程度较高、生长快、浸润性较强，易发生早期淋巴结转移，且转移率较高。由于其位置的特殊性，以及放疗、化疗副作用较大，术后复发率及转移率均较高，5年存活率在50%-60%左右［1-2］。目前，TSCC的临床治疗主要采用手术为主、放化疗为辅的综合治疗方法。中药野黄芩苷又名灯盏花乙素，是从黄芩茎叶及灯盏细辛等药物中分离得到的黄酮类化合物，在抗炎、抗微生物、抗变态反应、抗肿瘤等多方面都有一定的药理作用［3］。杨鹤松［4］的研究显示，野黄芩苷在一定浓度下对LA795瘤株的体内增殖具有明显的抑制作用；另有学者研究发现［5］，野黄芩苷可通过激活caspase-6、致敏5-氟尿嘧啶等药物诱导结肠癌细胞凋亡。本研究通过观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas、FasL蛋白表达的影响，探讨野黄芩苷对人舌鳞癌细胞是否具有凋亡诱导作用，以期为野黄芩苷应用于临床治疗舌癌提供理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器 人舌鳞癌Tca8113细胞株（南京凯基生物科技有限公司），野黄芩苷（中国药品生物制品检定所），胎牛血清（FBS，中美合资兰州民海生物工程有限公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司），CO2培养箱（SANYO，日本），倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）。

1.2实验分组 细胞分为对照组、不同浓度野黄芩苷药物组。对照组Tca8113细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养；不同浓度野黄芩苷药物组细胞分别用含野黄芩苷终浓度为80µg/ml、120µg/ml、160µg/ml的RPMI 1640培养液处理细胞。

1.3人舌鳞癌Tca8113细胞的培养 将人舌鳞癌Tca8113细胞株用含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2培养箱内进行培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，隔2-3天传代一次，取对数生长期的细胞用于实验，细胞消化液为0.25%的胰蛋白酶。

1.4免疫细胞化学法检测Fas、FasL的表达 三个野黄芩苷药物组在野黄芩苷处理细胞48h后甲醇固定细胞爬片，小牛血清封闭，一抗（1：50）4℃孵育过夜，DAB显色，光镜下观察Fas、FasL的表达情况。

1.5结果判定 以细胞浆和（或）胞膜出现棕黄色颗粒，强度大于背景非特异性染色判定为阳性产物。每个标本选择5个具有代表性的视野（×200倍），计数阳性细胞百分率：-，阳性细胞＜25%；+，阳性细胞25%-50%；++，阳性细胞51%-75%；+++，阳性细胞76%-100%。

1.6统计分析 数据采用SPSS 15.0统计学软件进行处理，组间比较采用秩和检验，两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

免疫细胞化学染色结果显示：Fas和FasL阳性细胞的胞浆和胞膜呈棕黄色，对照组细胞胞浆着色很浅，野黄芩苷药物组细胞随药物浓度的增加胞浆棕黄色逐渐增强。各组细胞Fas和FasL的表达水平比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；随着野黄芩苷药物浓度的增加，Fas和FasL的表达水平逐渐升高（P＜0.05）。见附表：

附表 人舌鳞癌Tca8113细胞Fas、FasL蛋白的表达情况

3　讨论

肿瘤的发生与细胞凋亡过程被抑制、细胞增殖与凋亡间的平衡被破坏有关。Fas/FasL是介导细胞凋亡信号转导途径最主要的系统［6］。Fas是一种分子量为45kDa的膜蛋白，属Ⅰ型跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，分子结构包括3个部分：膜外的N末端区、跨膜区和胞浆的C末端区。其N端有3个富含半胱氨酸、长度约40个氨基酸的死亡结构域（DD），是介导细胞凋亡的功能区。正常生理情况下，Fas在很多细胞中均有表达。FasL是一种分子量约为40kDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白，为Fas的天然配体，仅有活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞、肿瘤细胞和免疫赦免区域内的体细胞等特定的细胞表达FasL。Fas与配体结合后发生三聚化，DD区与接头蛋白FADD（Fas相关死亡结构域蛋白）的DD区结合，FADD的N端通过死亡效应结构域（DED）与caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活caspase-8，启动caspase级联反应，导致细胞凋亡［7］。

研究发现，肿瘤细胞普遍存在低表达或不表达Fas的现象，癌细胞Fas表达下调以抵抗FasL表达导致的TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）、CTL（细胞毒性T淋巴细胞）的免疫攻击，因此有利于癌细胞生长。王建广等［8］探讨Fas基因与人口腔鳞癌细胞凋亡的关系，结果显示口腔鳞癌组织Fas蛋白的阳性表达率有不同程度的下降。Muraki［9］等研究发现，口腔鳞状上皮癌Fas的表达与化疗反应、生存时间、肿瘤复发有关，Fas表达阴性组对化疗反应弱，后果不佳；而Fas阳性组对化疗反应良好，后果佳。

本研究分别用浓度为80µg/ml、120µg/ml、160µg/ml的野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h后，采用免疫细胞化学法染色检测Fas、FasL蛋白表达的情况，结果显示，用药组Tca8113细胞Fas和FasL的表达水平明显高于对照组，并且随着野黄芩苷药物浓度的增加，Fas和FasL的表达水平逐渐升高。因此提示，野黄芩苷可能通过增加Fas和FasL的表达水平，促进肿瘤细胞凋亡。但要将野黄芩苷应用于临床抗肿瘤治疗，还需进一步深入探讨其促肿瘤细胞凋亡的机制。

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[3]Chung CP,Park JB,Bae KH.Pharmacological effects of methanolic extract from the root of scutellaria baicalensis and its fl avonoids on human gingival f ibroblast[J]. Planta Med,1995, 61(2):150-153.

[4]杨鹤松.黄芩茎叶总黄酮对LA795小鼠肺腺癌的抑制作用［J］.承德医学院学报，2008，25（4）：439.

[5]Chan JY,Tan BK,Lee SC.Scutellarin sensitizes drug-evoked colon cancer cell apoptosis through enhanced caspase-6 activation[J]. Anticancer Res,2009,29(8):3043-3047.

[6]Nagata S,Golstein P.The Fas death factor[J].Science,1995,267 (5203):1449-1456.

[7]Wajant H.The Fas signaling pathway: more than a paradigm[J]. Science,2002,296(5573):1635- 1636.

[8]王建广，黄洪章，潘朝斌，等.口腔鳞状细胞癌Fas基因表达与细胞凋亡关系的研究［J］.华西口腔医学杂志，2004，22（4）：334-336.

[9]Muraki Y,Tateishi A,Seta C,et al.Fas antigen expression and outcome of oral squamous cell carcinoma[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2000,29(5):360-365.

EFFECTS OF SCUTELLARIN ON EXPRESSION OF FAS AND FASL IN HUMAN TONGUE SQUAMOUS CARCINOMA TCA 8113 CELLS

LI Ge， LI Jun-mei， GE Zhi-hua， et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To observe the effects of scutellarin on expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Methods: Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells were cultured in vitro and divided into control group and 3 scutellarin groups with different concentrations （80μg/ml，120μg/ml， 160μg/ml）. Immunocytochemical stain was used to detect the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Results: The Fas and FasL expression level in Tca8113 cells of scutellarin groups was obviously higher than that of control group （P＜0.05）； Moreover， with increasing of scutellarin concentrations， the Fas and FasL expression increased gradually （P＜0.05）. Conclusions: Scutellarin may promote tumour cells apoptosis by upregulating the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells.

Scutellarin； Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells； Fas； FasL

R739.86

【文章编号】1004-6879（2016）01-007-03

2015-05-26）