全氟辛烷磺酸（PFOA）对斜生栅藻的毒性效应研究

蒋美卿　许晓路　张德勇

（1浙江金象科技有限公司浙江东阳3221002浙江树人大学生物与环境工程学院浙江杭州310015）

全氟辛烷磺酸（PFOA）对斜生栅藻的毒性效应研究

蒋美卿1许晓路2*张德勇2

（1浙江金象科技有限公司浙江东阳3221002浙江树人大学生物与环境工程学院浙江杭州310015）

为了分析全氟辛烷磺酸（PFOA）对淡水生态系统的危害，选择斜生栅藻为受试对象。首先设计了急性毒性试验，计算出PFOA对斜生栅藻的96h-EC50值为139.23 mg/L。然后将斜生栅藻在含有不同浓度PFOA的培养基中连续培养8天，测定叶绿素、抗氧化酶、丙二醛等指标的变化。结果显示，斜生栅藻的叶绿素含量在PFOA达到50mg/L剂量时开始表现出降低，抗氧化酶类的活性在PFOA达到50mg/L或100mg/L剂量时表现出降低，MDA含量在PFOA达到150mg/L剂量时开始表现为上升。研究结果显示PFOA在高浓度下会影响藻类的光合作用及多种代谢活动。

PFOA；斜生栅藻；叶绿素；抗氧化酶；丙二醛

全氟辛烷磺酸（PFOA）分子式为C8F17SO3，它由全氟化酸性硫酸基酸中完全氟化的阴离子组成。PFOA是一种持久性有机污染物，具有难以降解、易于经食物链在各级生物体内蓄积等特点。PFOA分子中的碳氟键高度稳定，水解、光解、生物降解等手段均难以对其发挥降解作用[1]。半个多世纪以来，PFOA作为表面保护剂广泛应用于毛毯、皮革、纸张、包装材料、纤维等产品，或作为表面活性剂应用于起泡剂、酸雾抑制剂、碱性清洁剂、地板抛光剂、感光胶片、义齿清洁剂、洗发水等[2]。目前在全球大多数水系中均能检测到PFOA的污染，其潜在的生态威胁受到高度关注。包括欧盟国家、美国等在内的许多国家已经采取措施限制相关产品的生产和使用。

已有的研究显示，PFOA对鱼类、禽类、大鼠等动物具有多种毒性，涉及生殖毒性、胚胎发育毒性、肾脏毒性等，但在藻类上的研究报道尚且不多见，相关研究尚不够系统和深入[3]。藻类是水生生态系统中初级生产者，对整个生态系统的生产力和生态平衡至关重要。有些藻类甚至被作为水质评价的指标，因为它们往往在净化水体富营养化中起到重要作用，对环境变化反应敏感[4]。斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）是一种常见的淡水绿藻，易于在营养丰富的水体中繁殖，是一种常用的水质评价指示生物。由于斜生栅藻易于人工培养，也经常用于生态毒理学研究领域。本研究主要拟研究水中的PFOA对斜生栅藻的繁殖及一些关键的生化指标有何影响，以初步揭示其对水生生态系统的潜在毒性。

1　材料与方法

1.1材料

斜生栅藻由中科院水生生物研究所提供；PFOA购自百灵威公司；其他常规化学试剂由浙江树人大学生态与环境保护研究所提供。

1.2藻类培养与染毒方案

斜生栅藻接种于含不同浓度PFOA的HB-4培养基，于250mL的锥形瓶进行培养，起始浓度为7×105个/mL[5]。急性毒性实验中PFOA浓度为80mg/L～600 mg/L，慢性毒性实验中为20 to 250 mg/L。藻类培养过程中用4层纱布封口，于24℃、光照黑暗循环(12h/12h)条件培养8天，每天摇动5次。每组设3个重复。每天取样分析增殖速度，实验结束（8天）后测定叶绿素含量、抗氧化酶系、MDA等。

1.396h-EC50计算

藻类的生物量用光密度法进行快速测定，基于前期研究中建立的公式“y=0.0134x+0.036”进行藻类细胞密度换算。式中y为A690值，x为细胞数量（*106个/mL）。分别计算出不同浓度PFOA染毒96h后，对藻类生长的抑制率，利用Jiang等报道的方法，计算96h-EC50值[6]。

1.4叶绿素含量分析

取30mL藻液用0.45μm滤膜过滤截留藻细胞，将其带滤膜剪碎移入研钵，加入少量乙醇研磨，离心后滤液定容到10 mL，于4℃黑暗环境中提取4 h。提取液3000rpm离心20 min，取上清，移入10mL比色管。用90%乙醇定容至10 mL。取上清液于比色皿中，以90%乙醇溶液作参比，于分光光度计上提取液的A665和A649值。叶绿素a浓度（mg/L）=13.95A665-6.88A649；叶绿素b浓度（mg/L）=24.96A649-7.32A665。二者之和为叶绿素浓度。

1.5抗氧化酶系的活力分析

取30mL藻液，4000g离心15 min，沉淀用pH7.8的PBS重悬，进行超声破碎。10000g离心10 min，上清作为粗酶液，分别测定过氧化氢酶（CAT）、超氧化歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活力。CAT的测定，反应体系中加6 mL0.05 mol/LPBS(pH7.0)、0.4 mL 0.3%H2O2，、0.1 mL粗酶液。每分钟使A240值升高0.01的酶活力定义为1个CAT酶活单位[7]。SOD活性分析采用Chen等报道的方法，能抑制该反应体系每分钟ΔA560值达50%抑制率的酶活力定义为1个酶活单位[7]。POD活力的测定参照Bewley等报道的方法，使该反应体系每分钟A470变化值达0.01的酶活力定义为1个单位[8]。单位质量藻样中的酶活力=总酶活/样品总重。

1.6丙二醛（MDA）含量分析

30mL藻液经滤膜浓缩后，加入10%TCA，直接研磨破碎藻细胞，匀浆经10000g离心10min，上清液为丙二醛提取液。吸取2 mL提取液于试管中，加入0.6%硫代巴比妥酸2 mL，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4000 g离心10min，取上清，测A450、A532、A600值。MDA的浓度=6.45（A532-A600）-0.56*A450[9]。

1.7统计分析

利用SPSS软件(V11.5)，采用One-wayANOVA方法分析不同实验组结果之间的差异显著性。

2　结果

2.196h-EC50值

抑制率(P%)和浓度的自然对数(LnC)的线性回归方程：y=0. 2968x-0.9164，R2=0.9964。经计算，PFOA对斜生栅藻的96h-EC50值为139.23 mg/L。

2.2叶绿素及MDA含量

表1所示，当PFOA剂量大于或等于50 mg/L时，引起斜生栅藻中叶绿素a的含量降低（p＜0.05）；当PFOA剂量大于或等于100 mg/L时，引起斜生栅藻中叶绿素b的含量及总叶绿素含量降低（p＜0.05）；当PFOA剂量大于或等于150 mg/L时，引起斜生栅藻中MDA含量升高（p＜0.05）。这些结果显示PFOA会影响斜生栅藻中的叶绿素含量与MDA含量。

表1　各处理组的叶绿素含量及MDA含量

2.3抗氧化酶的活性

如表2所示，当PFOA剂量大于或等于50 mg/L时，引起斜生栅藻中SOD活力降低（p＜0.05）；当PFOA剂量大于或等于100 mg/L时，引起斜生栅藻中CAT活力与POD活力降低（p＜0.05）。

表2　各处理组的三种抗氧化酶类的活性

3　讨论

在世界各地的水系中普遍检测到PFOA污染，而关于其对水生生态系统的危害研究报道尚较少。本研究PFOA对斜生栅藻具有毒性效应，能抑制藻类的增殖，并就算出其96h-EC50值139.23 mg/L。八天的染毒实验进一步证实，这种PFOA暴露会引起斜生栅藻的叶绿素含量下降、MDA含量上升及抗氧化酶类的活性降低。这种效应大多于PFOA剂量达到50mg/L时开始表现出来。当PFOA剂量达到250 mg/L时，叶绿素a含量降低了约77%，叶绿素b含量降低了约45%，MDA浓度升高了约53%，CAT活力降低了约80%，POD活力降低了约74%，SOD活力降低了约77%，反映了高浓度的PFOA对藻类的生理活动影响非常明显。

本研究主要分析了藻类的叶绿素、抗氧化酶类活性、MDA含量几个重要的指标。叶绿素是藻类进行光合作用的基本依赖条件，其含量多少直接反映了藻类代谢和增殖活力的强弱。本研究中当PFOA剂量达到100 mg/L时，不管叶绿素a还是叶绿素b均开始表现出含量下降（p＜0.05），反映了PFOA对藻类的光合作用有影响，且与剂量有关。抗氧化酶类通过清除细胞内产生的过多的活性氧可以帮助藻类保持氧代谢平衡，保护细胞膜免受膜脂过氧化损伤，从而维持细胞的完好性。在本研究中，低剂量的PFOA（低于50 mg/L）虽然引起了抗氧化酶类的活性平均水平稍低，但不具有统计学显著性，这种抑制作用从PFOA剂量达到50 mg/L时开始逐步显现，并与剂量表现出正相关。MDA含量是细胞膜质过氧化的产物，其含量可反映植物遭受逆境伤害的程度，作为一种抗逆性分子，它在植物处于胁迫环境中时会大量产生，本研究中MDA浓度在PFOA剂量达到150mg/L时开始显著升高（p＜0. 05），显示在高浓度PFOA环境中，藻类会发生严重的膜脂过氧化，也就意味着细胞的损伤。

4　结语

本研究证实了高浓度的PFOA对水体中的藻类有多方面的毒性作用，会对藻类的光合作用、抗氧化酶类的活力、膜脂完好性等有损害，说明PFOA大量排放会对淡水生态环境造成威胁，应引起重视。

[1]Giesy,J.P.&Kannan,K.2002.Perfluorochemical surfactants in the environment.Environ Sci Technol,Vol.36,p.146A-152A.

[2]Giesy,J.P.&Kannan,K..2001.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife.Environ Sci Technol,Vol.35,p.1339-1342.

[3]Lau,C.,Anitole,K.,Hodes,C.,et al.2007.Perfluoroalkyl acids:a reviewofmonitoring and toxicological findings.Toxicol Sci.,Vol.99-2, p.366-394.

[4]Li,L.J.2007.Studies on Effects of Vanadate and Vanadium Complex on Growth and Physiology of Two Marine Microalgae,publications/Ocean UniversityofChina,Qingdao,p.11.

[5]Shen,Y.F.&Zhang,Z.S.1990.Modern biomonitoring techniques using fresh water microbiota.Publications/China Archiurf&Building Press,Beijing,p.275-286.

[6]Jiang,Y.L.,Lu,S.Z.&Shen,D.L.1996.Cellular biological experiment.publications/Fudan UniversityPress,Shanghai,p.16-17.

[7]Chen K.,Zhu,T.,Zhang,Y.T,et al.2009.Effect ofnitric oxide on N metabolism and Thylakoid membrane in Chlorella pyrenodosa response to UV-B radiation,Ecology and Environmental Sciences,Vol.18,p. 865-868.

[8]Bewley,T.D.1979.Physiological aspects of desiccation tolerance. Ann RevPlant Physiol.Vol.30,p.195-238.

[9]Srivastava,O.P.&Huystee,V.P.B.1973.Evidence for close association of POD polyphenol oxidase and IAA oxidase isoenzyme of peanut suspension culture medium.Can J Bot,Vol.51,p.2207-2215.

蒋美卿（1974—)，女，浙江东阳人，本科，工程师，主要从事工程设计、环境保护等方面的研究。