酿酒酵母菌生长特性的研究

刘龙海，李新圃，杨 峰，罗金印，张 哲，2，李宏胜

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050；2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

酿酒酵母菌生长特性的研究

刘龙海1，李新圃1，杨 峰1，罗金印1，张 哲1，2，李宏胜1

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050；2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

为探究温度和pH值对酿酒酵母菌生长特性的影响，采用单因素实验设计，检测了不同温度、不同初始pH值对酿酒酵母菌生长的影响。结果表明，培养基pH值和温度对酿酒酵母菌的生长具有明显的影响，当pH值为3.0或者8.0，温度为20℃或高于40℃时，酿酒酵母菌的生长明显受到抑制；酿酒酵母菌在培养基初始pH值为4.0～6.0，温度在25～30℃时生长良好。

酿酒酵母；温度；pH值；生长特性

酿酒酵母菌是一种与人们日常生活关系最为密切的酵母菌。酿酒酵母菌不仅含有丰富的蛋白质、核酸、维生素、微量元素等营养物质，而且部分酵母菌的培养液具有杀菌或抑菌作用［1-3］。研究发现，在奶牛饲料中添加活性酿酒酵母菌可以改善奶牛食欲、促进瘤胃蠕动、增强纤维消化能力、平衡瘤胃酸碱度、防止瘤胃酸中毒和提高奶产量和乳脂含量［4-8］。根据最新农业部2013年公布的饲料添加剂品种目录，酿酒酵母菌可直接作为饲料的活性添加剂，而酿酒酵母培养物、酿酒酵母提取物、酿酒酵母细胞壁等列入饲料原料品类，这表明酿酒酵母类产品在饲料产业中的比例将越来越大。

为提高酿酒酵母菌发酵的产量和效率，研究人员对酿酒酵母菌的生长特性进行了研究，结果表明，培养温度、pH值、水分含量、氧化应激、渗透压、产物浓度等因素能影响酿酒酵母菌的生长特性［9-11］。其中，培养基的pH值与培养温度是影响酿酒酵母生长最重要的因素之一，它们可通过影响酿酒酵母菌内的生化反应进而影响酿酒酵母菌的生长。

在前期实验中，从奶牛饲草饲料中分离出一株有抑菌活性的酿酒酵母菌，为了在临床上使用，本实验采用单因素设计，进行了培养温度和pH值对此酵母菌生长特性的影响，旨在为该酿酒酵母菌产业化开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 酿酒酵母菌菌株Y11，分离自甘肃省某奶牛场采集的饲草饲料样本，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所奶牛乳房炎课题组分离、鉴定和保存。

1.1.2 培养基及试剂 YEPD培养基购自北京吉美生物技术有限公司；琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 菌种的活化

将冻存的酿酒酵母菌菌株接种至装有30 mL YEPD液体培养基的三角瓶中，置28℃恒温振荡培养箱，120 r/min培养48 h。镜检纯粹后接种到YPD固体培养基，置恒温培养箱，28℃培养48 h，取出后4℃冰箱中保存。实验前，挑取单菌落接种至2 mLYEPD液体培养基的试管中，置28℃恒温培养箱中培养48 h。

1.3 酿酒酵母菌活菌计数

本实验酿酒酵母菌计数方法采用稀释平板计数法。对培养的酿酒酵母菌菌液进行10倍梯度稀释，取3个合适稀释浓度的菌液各100 μL，分别涂布至YEPD固体培养基，置恒温培养箱中，28℃培养48 h，每个稀释度做3个平行试验。培养结束后，取出平板，观察菌落生长情况，选取菌落数目在30～300之间的平板进行细菌计数，计算得出酿酒酵母菌的活菌数量，记录数据并取平均值。

1.4 酿酒酵母菌液浓度测定

本实验通过测定酵母菌培养液的OD值来估算酿酒酵母菌的浓度。对培养的酵母菌菌液进行5倍、10倍、15倍、20倍稀释，取合适浓度酿酒酵母菌菌液加入比色管，以无菌YEPD液体培养基作空白对照，用分光光计在450 nm波长进行OD值测定，3次测定取平均值。

1.5 酿酒酵母菌的生长特性研究

1.5.1 不同pH值的培养基对酿酒酵母菌生长特性的影响 将配制好的YEPD液体培养基，分装于9个150 mL三角瓶，每瓶50 mL，112℃、20 min高压灭菌，放凉后用无菌1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调整每瓶培养基pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0。

将活化的酿酒酵母发酵液以1%的接种量分别接种到不同pH值的YEPD液体培养基中，置28℃恒温振荡培养箱，120 r/min培养。分别于12、20、24和36 h取样，进行1∶20倍稀释后，用分光光计在450 nm波长进行OD值测定，同时取发酵液进行pH值测定及平板活酵母菌计数。

1.5.2 不同温度对酿酒酵母菌生长特性的影响 按1%的接种量将活化菌液分别接种到YEPD液体培养基中，置恒温振荡培养箱，120r/min，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下进行培养，并于24 h、36 h、48 h取样进行1∶5倍稀释后在波长450 nm处测定OD值，同时取样进行平板活酵母菌计数。

2 结果与分析

2.1 不同pH值对酿酒酵母菌生长的影响

2.1.1 酿酒酵母菌生长过程中培养基pH值的变化 从图1可以看出，酿酒酵母菌在不同pH值的培养基中生长时，随培养时间的增加，其培养液中的pH值逐渐降低，一般在培养20～24 h时培养基pH值下降到最低，在36 h时培养基pH值又有所上升。培养基初始pH值越高，酿酒酵母菌培养液中pH值下降的速度越快，当下降至2.0～4.0时，培养液中的pH值趋于稳定。详见图1。

2.1.2 培养基初始pH值对酿酒酵母菌生长的影响 从图2可以看出，酿酒酵母菌培养基的初始pH值过低或过高均对酵母菌的生长有明显影响。当pH值为3.0或者8.0时，酿酒酵母菌的生长明显受到抑制；当培养基初始pH值在4.0～6.0之间时，酿酒酵母生长情况较好，其中pH值为4.0时最适合该酵母菌生长。详见图2。

图2 不同pH值的培养基对酵母菌生长的影响

2.2 不同温度对酿酒酵母菌生长的影响

从图3和图4可以看出，温度对酿酒酵母菌的生长有非常大的影响。酿酒酵母菌在30℃培养时生长最为迅速，对数生长期提前，36 h达到生长高峰期。而温度过低（20℃）会造成酵母菌生长缓慢，生长高峰期延后。温度过高（超过40℃）亦会抑制酵母菌生长，造成酵母菌生长缓慢及死亡。

综合来看，该酿酒酵母菌的最佳生长温度为25～30℃，其中以30℃为最佳。通过OD值检测和活菌数量检测发现，两种检测方法存在差异，在低温时趋势基本一致，而温度超过40℃则会使酵母菌活菌数量减少，而OD值还可缓慢增加。

图3 温度对酿酒酵母菌生长的影响（活菌计数）

图4 温度对酿酒酵母菌生长的影响（OD值）

3 讨论

Woo等［11］研究发现，酿酒酵母的生长速率明显受到环境变化的影响，其中温度和pH值是主要的两个方面。温度是一种几乎可以影响细胞内所有生物化学进程的因素［12］。高温可使一些蛋白、DNA、RNA变性，并且会影响细胞生物膜的结构和功能［11］，而低温会抑制细胞内参加代谢反应酶的活性，从而影响酿酒酵母的生长。酿酒酵母最适生长温度为28～30℃，培养温度若高于45℃，酿酒酵母会对温度非常敏感；培养温度若在50℃持续5 min，酿酒酵母菌株99%会死亡［13］。本研究结果表明，该酿酒酵母的最适生长温度为25～30℃，若温度高于40℃，就会大量死亡，此结果与Molon M等［13］的研究结果基本一致。Jong等［14］研究了温度对从猕猴桃中分离的酿酒酵母菌生长的影响，结果发现，最佳发酵温度为35℃。此结果与本实验结果略有差异，产生此结果的原因在于其评价标准为乙醇产量而不是酿酒酵母的活菌数量。这与Ji等［11］的研究，随着温度高于38℃，酿酒酵母的生长速率会降低，而乙醇的生成量会缓慢升高的结果基本一致。

研究发现，大多数酿酒酵母能在pH值为2.5～8.0的培养基中生长，由于酿酒酵母有嗜酸性，根据培养温度、氧化应激、培养基和菌株的不同，最佳生长pH值约在4～6之间［15-16］。培养基初始pH值过高或过低均会影响酵母菌的生长。Liu等［17］研究发现，当pH值低于3时，酵母菌的停滞期会延长，最大OD值会降低；当pH值在2.5时，酵母菌生长完全被抑制；Antonio等［18］发现，当pH值为8时酵母菌生长速度显著降低，pH值为9时生长完全停止。本实验结果表明，此酵母菌最适的pH值范围为4.0～6.5，以pH值为4.0时最适合该酵母菌生长；初始培养基pH值为3.0时，可明显看出该酵母生长缓慢，最大OD值明显低于其他组。该结果与上述Narendranath等［16］、Liu等［17］、Antonio等［18］的研究结果基本一致。

温度和pH值还可通过影响发酵副产物进而影响酿酒酵母菌的生长。乙酸是酿酒酵母发酵过程产生的主要酸性物质，它可以作为诱导物引发细胞的程序化死亡［19］，而高温可增加酿酒酵母菌发酵液中的乙酸含量［11］。因此，高温和低pH值是影响酿酒酵母生长的原因之一。

此外，研究发现，氧化应激、培养基组成、渗透压等因素均会影响酿酒酵母的生长［4-6］，这些因素对本实验的酿酒酵母菌是否有影响有待进一步实验证实。

4 结论

培养基初始pH值和培养温度均会影响此酿酒酵母菌的生长特性，研究表明，此酿酒酵母菌的最适生长温度在25～30℃之间，最适pH值在4.0～6.0之间，超出此范围，酿酒酵母菌的生长会受到抑制。

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Effects of Temperature and pH on the Growth of Saccharomyces cerevisiae

Liu Longhai，Li Xinpu，Li Hongsheng，et al
（KeyLaboratoryofNewAnimal DrugProject ofGansu Province，KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceutical Discovery，MinistryofAgriculture，Lanzhou Institute ofAnimal Husbandryand Pharmaceutical Sciences，Chinese AcademyofAgricultural Sciences，Lanzhou 730050，China）

To investigate the effects of temperature and pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae，the influence of different temperature and pH were determined on Saccharomyces cerevisiae growth by single factor design.The results indicated that the temperature and pH of mediu would significantly affected the growth characteristics of Saccharomyces cerevisiae.The Saccharomyces cerevisiae growth would be inhibited when exceed the temperature（20-40℃）or the pH（3.0-8.0）.In this study，the optimum growth temperature of Saccharomyces cerevisiae is 25-30℃，the optimum growth pH is 4.0-6.0.This study laid a foundations for the application offermentation process.

Saccharomyces cerevisiae；temperature；pH；growth characteristics

S816.6

A

2095-3887（2016）03-0038-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.010

2016-01-21

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD12B03）；甘肃省科技支撑计划（144NKCA240）；甘肃省农业科技创新项目（GNCX－2013－59）；中国农业科学院奶牛疾病创新工程（CAAS-ASTIP-2004-LIHPS-03）

刘龙海（1990-），男，硕士，主要从事奶牛乳房炎疫苗研究。

李宏胜（1964-），男，研究员，博士，主要从事奶牛乳房炎免疫及预防研究。