牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

马梦婷，高庆华，王姗姗，陈晓利，郑永富

（1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；3.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300）

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

马梦婷1，2，高庆华1，3，王姗姗1，3，陈晓利1，郑永富1，3

（1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；3.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300）

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物，对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析，以鉴定性别。结果表明：利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别，雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带，雄性产生1条源于X染色体的条带（311 bp）和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带，对10枚胚胎进行鉴定，6枚为雄性，4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠，准确性和敏感性较高。

牙釉质基因；牛；胚胎；性别鉴定；巢式PCR

性别控制一直是家畜及经济动物生产繁育的重要环节，通过人为控制获得所需性别后代可以提高优秀母畜利用率，同时可加快繁殖速率［1-2］。性别鉴定可以在胚胎移植前确定胚胎性别，根据需要移植不同性别胚胎，从而达到人为控制家畜后代性别的目的。性别鉴定方法众多，现阶段最为常用的方法为聚合酶链式反应（PCR），此方法能够快速准确地完成性别鉴定［3］。PCR技术鉴定早期胚胎性别多使用Y染色体所特有的基因SRY，SRY是哺乳动物的性别决定基因［4］，只有雄性会被扩增。无法准确判断胚胎为雌性或者未扩增成功，需要设计一对常染色体基因引物作为对照。哺乳动物的牙釉质基因（amelogenin）在猪［5］、牛［6］、羊［7］的X染色体和Y染色体上均可以被检测到，但其在两条性染色体上的长度不同，只需设计一对引物就可以扩增出不同长度的X染色体及Y染色体序列，更为简便。本实验根据牛牙釉质基因序列设计巢式扩增的内、外引物，对牛早期胚胎进行性别鉴定，以期建立一种高效、快速、准确的牛早期胚胎性别鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

DL-2000 DNAmarker、琼脂糖均购自Takara公司；2×EasyTaq○RPCR SuperMix DNA聚合酶及血液基因组DNA提取试剂盒购自Transgen公司。

高速冷冻离心机（Sigma30，德国），凝胶成像系统（GELDOC2000，德国），电热恒温水浴锅（HH-S，江苏），稳压稳流电泳仪（DYY-2，北京），PCR扩增仪（TC-500，Techne）连续变倍体视显微镜（XTZ-D，上海）。

牛胚胎为新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室保存。

1.2 DNA样品制备

牛静脉血基因组DNA提取使用Transgen公司的血液基因组DNA提取试剂盒进行。提取的血液基因组DNA经紫外分光光度计检测浓度后10倍稀释至10pg/μL。

牛胚胎DNA提取使用水煮法，胚胎从液氮中取出后37℃水浴解冻，排除甘油，分别装入10个1.5 mLEP管，加入20 μL灭菌去离子水，沸水加热处理10 min，转入冰浴，冷却后4000r/min离心2min。

1.3 引物设计

根据据牛AMEL基因序列（AMELX，GenBank accession no.NM_001014984；AMELY，GenBank accession no. NM_174240），采用BLAST和Clustal W程序设计巢式引物，见表1。引物由上海生工合成。

表1 内、外引物序列

1.4 PCR扩增

第一轮PCR反应体系：Taq mix（50 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HC，3 mmol/L MgSO4，400 mmol/L dNTPs，0.1 U/μLTaq酶）10 μL，上下游巢式外引物（10 μmol/L）各0.2μL，1μL模板，6.6μL灭菌超纯水，共20μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共25个循环，最后72℃延伸7min。

第二轮PCR反应体系：Taq mix10 μL，上下游巢式内引物（10 μmol/L）各0.4 μL，取第一轮PCR反应产物5 μL作为模板，4.2 μL灭菌超纯水，共20 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共35个循环，最后72℃延伸7min。

1.5 琼脂糖凝胶电泳检测

制作1%的琼脂糖凝胶，取5 μLPCR扩增产物点样，电压200 V，15 min，电泳结束后EB染色7 min，于凝胶成像系统检测，PCR结果有两条带者为雄性，一条带者为雌性。

2 结果与分析

对浓度为10 pg/μL牛血液基因组DNA样品采用牙釉质基因巢式PCR扩增，扩增效果如图1所示，雌性胚胎扩增只得到源于X染色体的1条带（311 bp），雄性胚胎扩增得到一条X染色体条带以及源于Y染色体（251 bp）的1条带，共2条带。

图1 牛血液DNA（10 pg）牙釉质基因扩增部分结果

应用牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别，如图2所示，扩增得到1条带者为雌性，2条带者为雄性。10枚胚胎中，6枚为雄性，4枚为雌性。

图2 牙釉质基因巢式扩增鉴定牛胚胎结果

3 讨论

性别鉴定对所有哺乳动物繁殖生产有巨大意义。通过对早期胚胎性别鉴定可以有效地控制用于移植的胚胎性别，获得所需性别的后代。现阶段，性别鉴定多使用X染色体与Y染色体的差异表达基因进行扩增，如性别决定基因SRY以及与睾丸决定因子相近的ZFY基因［8］。SRY基因只存在于Y染色体上，扩增后只有雄性样品可以被扩增出现1条带，雌性样品不会被扩增，无法准确判断是雌性样品或者未扩增成功。经改进，研究人员使用Y染色体特异基因扩增时会选用常染色体上的1个基因作为对照［9］，从而增加了扩增结果的可靠性，然而对胚胎性别进行鉴定时，因为胚胎DNA模板量较少，PCR扩增容易出现失误，因此需要使用巢式PCR扩增来增大扩增效率及提高引物特异性，由此进行巢式PCR扩增就需要设计4对引物，引物设计复杂。本实验选择的牛牙釉质基因同时存在于X染色体和Y染色体上，却在X染色体及Y染色体上的长度及位置不同，存在60 bp的长度差异，利用这种特性，只需设计两对引物就可以通过巢式PCR扩增鉴定胚胎性别。

本实验使用牙釉质基因对10 pg（约3个细胞）［10］的牛血液基因组DNA样本及10枚牛早期胚胎进行性别鉴定，并获得成功，雌性扩增得到1条源于X染色体的条带（311bp），雄性扩增出1条源于X染色体的条带和1条源于Y染色体的条带（251bp），在验证牙釉质基因鉴定性别准确性的同时，证明了其高灵敏度。PCR扩增效率受底物浓度影响，底物浓度低有可能导致扩增失败，胚胎DNA模板量较少，扩增也容易达到平台期，只使用单纯PCR可能无法检测到扩增产物。Song等［11］的研究说明，巢式PCR扩增效率高于普通单次PCR效率100倍，因此在进行牛早期胚胎性别鉴定时，为提高灵敏性及特异性较常使用巢式PCR扩增技术，巢式PCR扩增的第二轮以第一轮反应产物为模板，可以获得更多的扩增产物，从而提高扩增效率。罗光彬等［12］应用巢式PCR法使用8个细胞鉴定牛早期胚胎性别获得成功；Park等［13］使用SRY基因鉴定胚胎性别发现，胚胎卵裂球数少于4个时，扩增的准确性及灵敏度都会下降，而使用牙釉质基因可以对单个胚胎细胞进行扩增，因此牙釉质基因扩增的灵敏度较高。本实验也验证了这一点。

通过早期胚胎性别鉴定可以有效地控制后代性别比率，从而提高家畜繁殖效率及经济效益，并且在早期胚胎性别鉴定中，切割胚胎量越少对胚胎移植效果影响越小。本实验使用巢式扩增牙釉质基因，灵敏度达到10 pg，大约为3个细胞的量［10］，验证了牙釉质基因用于鉴定胚胎性别的准确性及高灵敏度，为牛早期胚胎性别鉴定提供简便、可靠的方法。

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Sex Identification of Early Embryo in Bovine by Nested Amplification of Amelogenin Gene

Ma Mengting1，2，GaoQinghua1，3，WangShanshan1，3，et al
（（1.KeyLaboratoryofTarimAnimal HusbandryScience and TechnologyofXinjiang Production and Construction Groups，Alar 843300，China；2.College ofLife Science，TarimUniversity，Alar 843300，Xinjiang，China；3.College ofAnimal Science，TarimUniversity，Alar 843300，Xinjiang，China）

Based on the difference between AMEL-X and AMEL-Y genes of bovine，the nested primers were designed.Nested amplification and electrophoresis were used to identify the gender of bovine blood genomic DNA and 10 early embryos of bovine. The results showed that the nested PCR could identify gender on 10 pg genomic DNA.One 311 bp fragment from X chromosome in female，and a 311 bp fragment from X chromosome and a 251 bp fragment from the Y chromosome in male were found.10 embryos were identified，6 was male，4 was female.The method based nested PCR amplifying amelogenin gene for sex identification was highlyaccurate and sensitive.

amelogenin gene；bovine；embryo；sexidentification；nested PCR

S823.3

A

2095-3887（2016）03-0031-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.008

2016-03-29

塔里木大学研究生科研创新项目（TDGRI201401）

马梦婷（1991-），女，硕士研究生。

高庆华，教授，博士。