N-乙酰半胱氨酸对动脉粥样硬化大鼠血脂及氧化应激的影响

严俊 史婷婷 庄让笑 周晓霞 蔡兆斌

1.浙江中医药大学附属杭州西溪医院急诊科，浙江杭州310023；2.浙江中医药大学附属杭州西溪医院制剂室，浙江杭州310023；3.浙江中医药大学附属杭州西溪医院，浙江杭州310023

N-乙酰半胱氨酸对动脉粥样硬化大鼠血脂及氧化应激的影响

严俊1史婷婷2庄让笑2周晓霞1蔡兆斌3▲

1.浙江中医药大学附属杭州西溪医院急诊科，浙江杭州310023；2.浙江中医药大学附属杭州西溪医院制剂室，浙江杭州310023；3.浙江中医药大学附属杭州西溪医院，浙江杭州310023

目的探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对动脉粥样硬化大鼠血脂及氧化应激的影响。方法60只SD大鼠随机分为正常对照组（10只）和造模组（50只）。造模组大鼠通过高脂饮食联合维生素D3建立动脉粥样硬化模型，然后随机分为模型组、辛伐他汀对照组、NAC低剂量组、NAC中剂量组和NAC高剂量组，每组各10只。模型组喂以高脂饲料，辛伐他汀对照组每天灌胃辛伐他汀5 mg/（kg·d），NAC低、中、高剂量组每天灌胃NAC 100、200、300mg/（kg·d）。药物干预8周后，观察大鼠胸腹主动脉病理变化以及血脂［总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、氧化型低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL）］、血氧化应激指标［血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）］的含量。结果与正常对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL升高，血氧化应激指标SOD、GSH-Px降低，MDA增高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，NAC中、高剂量组和辛伐他汀对照组对照大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL降低，NAC低剂量组TC、LDL-C、ox-LDL降低，NAC各组和辛伐他汀对照组大鼠血氧化应激指标SOD、GSH-Px升高，MDA降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。NAC各组与辛伐他汀对照组相比，NAC低剂量组的LDL-C、ox-LDL升高，NAC高剂量组的LDL-C、ox-LDL降低，NAC低剂量组的SOD、GSH-Px降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；余指标之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论NAC可能通过调节血脂、抗氧化应激等多条途径发挥抗动脉粥样硬化形成的作用。

N-乙酰半胱氨酸；动脉粥样硬化；氧化应激

心脑血管疾病（cardiac-cerebral vascular disease，CCVD）已成为人类死亡的首要病因［1］。目前，我国CCVD患者已经超过2.7亿人，我国每年有近300万人因心脑血管疾病死亡，占我国每年总死亡病因的51%。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病最重要的病理基础，是引发心脑血管疾病最主要的危险因素［2］。AS的发病机制十分复杂，主要学说有脂质浸润学说、内皮功能紊乱学说、损伤反应假说、氧化假说等，但都不能全面解释AS的发生［3］。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）具有抗氧化、抗凋亡等作用［4］。本研究通过NAC对AS大鼠进行干预，观察大鼠动脉病理变化及血脂、血氧化应激指标情况，探讨NAC对AS大鼠血脂和氧化应激的影响。

1 料与方法

1.1 实验动物

选用SD大鼠60只，清洁级，由浙江省医学科学院提供，动物合格证编号：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 高脂饲料

配方：81.39%基础饲料，10%猪油，2%胆固醇，1%胆盐，0.61%丙基硫氧嘧啶和5%蛋黄粉。高脂饲料在浙江省医学科学院加工完成。

1.3 主要药物、试剂及仪器

N-乙酰半胱氨酸：武汉武大弘元药业，批号：20150512。辛伐他汀片：杭州默沙东制药有限公司，国药准字：H19990367。维生素D3注射液：上海通用药业，国药准字：H31021404，规格：每支30万U。试剂：氧化型低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

日立7060全自动生化分析仪（日立公司，日本）、ZMN-7803切片包埋机（常州市华利电子有限责任公司）、恒温水浴箱Model DK-8D（上海森信实验仪器有限公司）、低温高速离心机（Hettich公司，德国）、光学显微镜（奥林巴斯公司，日本）。

1.4 动物分组及造模

60只SD大鼠适应性观察1周，随机分为正常对照组（10只）和造模组（50只）。正常对照组以普通饲料喂养。造模组连续3 d腹腔注射维生素D360万U/kg，同时采用高脂饲料喂养。8周后，造模组随机分为模型组、辛伐他汀对照组、NAC低剂量组、NAC中剂量组和NAC高剂量组，每组各10只。模型组给予高脂饲料，辛伐他汀对照组灌胃给予辛伐他汀5 mg/（kg·d），NAC低、中、高剂量组每天灌胃给予100、200、300mg/（kg·d）NAC，继续饲养8周。饲养条件：实验期间各组大鼠分笼喂养，自由进食，日光灯照明，明暗各12 h。

1.5 标本采集

末次给药当晚禁食不禁水16 h，随后以3%的戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉。解剖大鼠，腹主动脉采血，室温放置2 h后3000 r/min离心10min，取上清液，放入-20℃冰箱保存待用。沿正中线剪开胸腹部皮肤分离并暴露胸腹主动脉，取出胸腹主动脉（从主动脉弓至髂总动脉分叉处），行HE染色观察病理变化。

1.6 指标检测

采用日立7060全自动生化分析仪检测血总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。采用固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）测定ox-LDL含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，硫代巴比妥酸反应法测定血清MDA含量；用5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）比色法测定GSHPx活性。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 果

2.1 各组大鼠主动脉病变程度

正常对照组大鼠肉眼观主动脉壁光滑，HE染色下动脉壁内膜薄而光滑，未见泡沫细胞，中层平滑肌层细胞核大小均匀，排列整齐，厚度正常，外层脂肪层薄，各层结构清晰完整。与正常对照组比较，模型组主动脉管腔变窄，HE染色下内膜增厚，向管腔内突起，出现泡沫细胞积聚，中层平滑肌细胞核大小不均，排列紊乱，细胞增生，外层脂肪层增厚，动脉壁三层结构紊乱。与模型组比较，NAC中、高剂量组和辛伐他汀对照组大鼠主动脉血管壁变薄，内膜相对平滑，平滑肌细胞排列相对整齐，接近正常对照组；而NAC低剂量组的主动脉血管壁增厚，平滑肌细胞排列紊乱、增生，接近模型组。见图1。

图1 各组大鼠主动脉病变程度（HE染色，200×）

2.2 各组大鼠血脂水平比较

与正常对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均有不同程度的增高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，NAC中、高剂量组和辛伐他汀对照组血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均有不同程度降低，NAC低剂量组TC、LDL-C、ox-LDL水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与辛伐他汀对照组相比，NAC低剂量组LDL-C、ox-LDL水平升高（P＜0.01），NAC高剂量组LDL-C、ox-LDL水平降低（P＜0.05）；其他指标各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂水平比较（x±s）

2.3 各组大鼠氧化应激指标比较

与正常对照组相比，模型组大鼠血清MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，NAC低、中、高剂量组和辛伐他汀对照组大鼠血清MDA水平降低，SOD、 GSH-Px水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与辛伐他汀对照组相比，NAC低剂量组SOD、GSH-Px水平明显下降（P＜0.01）；其他指标各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠氧化应激指标比较（x±s）

3 论

AS的发病机制十分复杂，脂质沉积、炎性反应、内皮损伤、氧化应激反应等多种病理环节共同参与其中。几十年来，普遍认为脂质是AS的元凶，血脂异常升高是AS的始动因素之一［5］。大多数AS模型的建立都是以高脂血症为基础，血脂水平的高低与AS的发生呈正相关［6］。周永刚等［7］采用高脂饲料联合维生素D3喂养大鼠，8周后发现高脂组大鼠血脂水平（TC、TG、LDL）明显增高，心脏、肝脏、主动脉等组织油红O染色阳性，表明大量脂质沉积，主动脉肉眼可见脂质斑块，油红O染色大面积红染。机体血脂水平升高，加速脂质在血管壁的沉积，进一步侵袭破坏血管壁，形成脂质条纹，是AS发生的基础，尤其是LDL-C沉积在血管壁后发生氧化反应形成ox-LDL，对内皮细胞、单核细胞等有很大的毒性和化学趋化作用。ox-LDL与内皮细胞、巨噬细胞等细胞膜上的凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）［8］相结合，可以损伤内皮细胞，使细胞膜的通透性增加，从而使ox-LDL内吞形成泡沫细胞，大量的泡沫细胞聚集在一起，使血管壁增厚，向外突出形成脂质斑块，导致AS的形成。因此，ox-LDL作为AS的独立危险因素之一［9］，越来越引起大家的重视。本实验中模型组大鼠血脂（TC、TG、LDL-C、ox-LDL）水平明显增高，AS病理改变明显；而各药物组大鼠血脂水平下降，AS病理改变有所改善。

氧化应激反应在AS病程中发挥着重要作用［10］，是其独立危险因素。氧化应激是指机体或细胞内氧自由基的产生与清除失衡，导致活性氧族（reactive oxygen species，ROS）过量积聚，从而引起的一系列氧化损伤反应［11］。当血脂升高时，机体抗氧化能力降低，ROS产生过量，氧化应激反应增强。过量的ROS可以使LDL中的不饱和脂肪酸发生氧化修饰形成ox-LDL，ox-LDL则进一步形成泡沫细胞，加速AS的形成。另外，氧化应激还能诱导细胞凋亡，血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡在AS中发挥着重要作用。其中，血管内皮细胞凋亡是AS发生的始动因素之一［12］。有实验表明，LDL和ox-LDL能够抑制高脂血症中血管扩张因子一氧化氮（NO）的产生与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，诱导血管内皮细胞凋亡，从而促进动脉粥样硬化的形成［13］。

正常机体内始终保持着氧化与抗氧化平衡。酶性抗氧化物质主要包括SOD、过氧化氢酶（CAT）、GSHPx等。各种抗氧化物质可以协同清除过量的ROS、氧自由基，从而减轻氧化应激对机体的损伤［14］。在这些抗氧化酶中，只有SOD能将超氧阴离子催化成相对稳定的过氧化氢，它可以清除氧自由基，减轻组织的过氧化损伤［15］。MDA是机体内脂质过氧化代谢的产物，可以直接反映机体脂质过氧化反应的强度，间接反映细胞损伤的程度。MDA是一个重要的氧化应激标志物［16］。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，它能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而减轻过氧化物对细胞的侵害，保持细胞膜的结构和功能完整。本实验中，模型组ox-LDL、MDA含量提高，SOD、GSH-Px活性下降，说明机体氧化应激水平提高，而各药物组上述指标改善，说明氧化应激水平改善。

NAC在临床上多年来作为黏痰溶解药，还具有抗过氧化损伤的作用。可能机制为NAC分子中有活性巯基（-SH），通过自身的-SH氧化还原参与氧化反应过程，具有干扰自由基生成、清除已生成的自由基、调整基因的表达和阻碍细胞信号转导、抗细胞凋亡等作用［17］。另外，NAC进入细胞脱乙酰基后生成半胱氨酸，可以促进谷胱甘肽（GSH）的合成，提高组织内GSH含量。GSH是体内重要的非酶性抗氧化剂和自由基清除剂，在机体抗氧化应激反应中发挥着重要作用［18］。目前国内已经有很多实验证实NAC对心脏、肝、脑、肺等组织有抗过氧化损伤的保护作用［19-20］。

本实验通过NAC对AS大鼠的干预，血脂指标明显下降，血氧化指标明显改善，AS病变程度减轻。初步证明了NAC可以通过调血脂、抗氧化应激等途径发挥抗AS的作用，值得进一步深入研究，为以后NAC的临床开发应用提供基础研究支持。

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Effectsof N-acetylcysteineon serum lipidsand oxidativestress in atherosclerosis rats

YAN Jun1SHITingting2ZHUANG Rangxiao2ZHOU Xiaoxia1CAIZhaobin3▲
1.Department of Emergency，Hangzhou Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China；2.Department of Pharmaceutic Preparation，Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China；3.Hangzhou Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China

Ob jective To study the effects of N-acetylcysteine on blood lipids and oxidative stress in atherosclerosis rats.M ethods 60 SD rats were random ly divided into the normal control group（n=10）and themodel group（n=50）. Rats in themodel group were established atherosclerosismodel by high-fat diet combined with vitamin D3，then，they were random ly divided into the model group，Simvastatin group，NAC low dose group，NAC middle dose group and NAC high dose group，each group had 10 rats.Then rats in themodel group were fed with high fat diet，the Simvastatin control group were administered with Simvastatin 5 mg/（kg·d），NAC low，middle and high dose groups were administered NAC 100，200，300mg/（kg·d）.After 8 weeks of drug intervention，the pathological changes in thoraco-abdominal aorta of rats were observed，blood lipid［total cholesterol（TC），three acyl glycerin（TG），low density lipoprotein（LDLC），oxidized low density lipoprotein cholesterol（ox-LDL）］and blood oxidative stress index［serum superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA）］were detected.Results Compared with the normal control group，the levels of serum TC，TG，LDL-C，ox-LDL in themodel group increased，the levels of antioxidant indicators SOD and GSH-Px decreased，the level of MDA increased，with statistically significant differences（P＜0.01）. Compared with themodel group，the levels of serum TC，TG，LDL-C，ox-LDL in NAC middle and high dose groups and the Simvastatin group decreased，the levelsof serum TC，LDL-C，ox-LDL in NAC low dose group decreased，the levels of SOD and GSH-Px in all NAC groups and the Simvastatin group increased，the level of MDA decreased，with statistically significant differences（P＜0.05）. Compared with the Simvastatin group，the levels of LDL-C，ox-LDL in the NAC low dose group increased，the level of LDL-C，ox-LDL in the NAC high dose group decreased，the level of SOD，GSH-Px in the NAC low dose group decreased，with statistically significant differences（P＜0.05）.There were no significant differences between the remaining indicators（P＞0.05）.Conclusion NACmay play an anti-atherosclerotic role by adjusting blood lipid，resisting oxidative stress and so on.

N-acetylcysteine；Atherosclerosis；Oxidative stress

R363

A

1673-7210（2016）05（c）-0013-05

2016-02-20本文编辑：程铭）

浙江省杭州市科技发展计划项目（20130633B09，20130733Q30）。

▲通讯作者