PMA与ddPCR结合检测单核细胞增生李斯特氏菌

王静，崔凤杰，秦燕，贾俊涛，魏玮，张慧敏

（1.威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东威海264205；2.山东出入境检验检疫局，山东青岛266500）

PMA与ddPCR结合检测单核细胞增生李斯特氏菌

王静1，崔凤杰1，秦燕1，贾俊涛2，魏玮1，张慧敏1

（1.威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东威海264205；2.山东出入境检验检疫局，山东青岛266500）

将叠氮溴化丙锭（PMA）与微滴数字PCR（ddPCR）技术相结合，检测热灭活背景下单核细胞增生李斯特氏菌活菌。结果表明，PMA终浓度为5.0 μg/mL、曝光时间为15 min时，可以有效抑制105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌死菌DNA的PCR扩增，不抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌DNA扩增的PMA最高浓度是10.0 μg/mL。利用PMA处理死活菌混合液时，PMA-ddPCR可以在死菌存在的条件下，定量检测活菌，降低了“假阳性”结果的出现。检测结果显示：PMA-ddPCR灵敏度是2.0copy/20μL。利用PMA-ddPCR检测人工污染的鳕鱼样品，最低可检出102CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌。结果证明PMA-ddPCR方法的精确度、稳定性良好。

叠氮溴化丙锭；微滴式数字PCR；单核细胞增生李斯特氏菌；活菌

随着社会的发展和人们对健康的关注，食品安全已经成为影响深远的社会性问题。然而，食品微生物引起的食源性疾病暴发事件层出不穷。单核细胞增生李斯特氏菌是一种常见的食源性致病菌，生命力很强，人感染后可导致脑膜炎、肠胃炎、败血症等［1-3］，严重危害人们身心健康。因此，定量检测单核细胞增生李斯特氏菌引起各国的高度关注。

目前，检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法有很多，比如实时荧光聚合酶链式反应［4］、荧光染色［5］、免疫学方法［6］等，虽然这些方法相比于传统培养法有一些优势［7-8］，但是还存在一些无法克服的缺点，诸如操作繁琐费时，灵敏度低，不能真实反映样品的污染水平，出现“假阳性”的结果［9-10］等。因此，开发定量检测活菌的方法是非常有必要的。叠氮溴化丙锭（PMA）是一种能和DNA共价交联的光敏材料，光照可以使PMA的光敏基团转化为氮宾自由基，其可以和DNA发生共价交联，进而阻断DNA分子的PCR扩增，并且PMA只能选择性的渗透死菌的细胞膜，因此PMA和PCR技术相结合在定量检测活菌方面有巨大的发展潜力［11-14］。

微滴数字PCR（ddPCR）是近年来发展起来的可以定量检测DNA的新方法，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性微滴数目［15-17］。本方法不需要核酸标准品，又兼具qPCR的优势。本文首次将PMA与ddPCR技术相结合，开发了高灵敏，高选择性的检测食源性致病菌的新方法。

1　材料与方法

1.1菌种

单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes（ATCC19115）：美国Microbiologics公司。

1.2试剂与仪器

PMA：1 mg，美国Biotium公司，溶解于1.0 mL 20%的DMSO溶液，得到1 mg/mL储备液，于-20℃避光保存；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、营养肉汤：北京陆桥；李斯特菌显色培养基：法国科马嘉；细菌基因组DNA提取试剂盒：北京Tiangen；引物、探针：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；荧光定量PCR反应体系有关试剂：购自罗氏公司；微滴式数字PCR反应体系有关试剂：购自美国伯乐公司。

QX200微滴式数字PCR系统：美国伯乐公司；7900HT Fast实时荧光定量PCR系统：美国应用生物系统公司；CF16RXII高速冷冻离心机：日本日立公司；卤钨灯（500 W）：飞利浦灯具（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1细菌培养及热灭活菌的制备

用接种环沾取甘油管保存的菌液，在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）平板上划线，于37℃下培养24 h。挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基，37℃培养至对数生长期。

取105CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌于1.5 mL离心管中，80℃水浴10 min后冷却至室温，吸取1 mL涂布于科马嘉李斯特菌显色培养基，37℃下培养24 h观察，未有菌落长出。

1.3.2最佳PMA浓度的选取

取500 μL热灭活菌于1.5 mL离心管中，分别加入 PMA使其终浓度为0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μg/mL，充分混匀后暗处孵育15 min，每隔5分钟颠倒混匀，使PMA最大限度进入受损细胞内。将离心管置于500 W卤钨灯下20 cm处曝光15 min（管口朝上，置于冰上），期间每隔5分钟混匀，以使样品溶液曝光均匀。随后用试剂盒法提取基因组DNA，进行荧光定量PCR检测。取500 μL单核细胞增生李斯特氏菌活菌作为对照组，处理同试验组。

1.3.3最佳曝光时间的选取

取500 μL热灭活菌于1.5 mL离心管中，加入终浓度5.0 μg/mL的PMA后暗处孵育15 min，置于卤钨灯下方20 cm处，分别曝光0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 min，随后用试剂盒法提取基因组DNA，进行荧光定量PCR检测。

1.3.4PMA-qPCR及PMA-ddPCR检测

采取试剂盒法提取的基因组DNA利用7900HT Fast实时荧光定量PCR系统和QX200微滴式数字PCR系统进行检测。参考SN/T1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》合成引物。上游引物为（23 bp）：5′-CTGAATCTCAAGCAAAACGTGGT-3′，下游引物为（18 bp）：5′-CGCGACCGAAGCCAACTA-3′，探针（Pr）：5′-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTG GCTGG-TAMRA-3′。

PMA-qPCR反应体系（25.0 μL）：12.5 μL LightCy clerR480ProbesMaster；10 mmol/L上、下游引物各1.0 μL；10 mmol/L探针0.5 μL；模板DNA 2.0 μL；最后用DEPC水补充至25.0 μL。qPCR扩增条件为：95℃、3 min；94℃、5 s，60℃、40 s，40个循环，同时收集FAM荧光。

PMA-ddPCR反应体系（20.0 μL）：10.0 μL ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）；10 mmol/L上、下游引物各1.0 μL；10 mmol/L探针0.5 μL；模板DNA 4.0 μL；最后用DEPC水补充至20.0 μL。ddPCR扩增循环条件为：95℃，5min；94℃、10s，60℃、45s，40个循环；98℃，10 min。

1.3.5qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测不同比例活、死菌混合液的比较

配制活菌比例为0%、10%、25%、50%、100%的单核细胞增生李斯特氏菌悬液，分别取500μL于1.5mL离心管中，qPCR组不加入PMA，PMA-qPCR、PMA-ddPCR组用PMA处理（终浓度为5.0 μg/mL，曝光15 min），按照试剂盒法提取基因组DNA，进行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测。

1.3.6PMA-ddPCR、PMA-qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度

将1.7×106CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌菌液10倍梯度稀释，制得浓度为106、105、104、103、102、101CFU/mL的菌液，分别标记为L6～L1。在优化条件下，进行PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测，分析灵敏度和线性关系。

1.3.7PMA-ddPCR、PMA-qPCR检测人工污染鳕鱼样品中的单核细胞增生李斯特氏菌

取25 g新鲜鳕鱼样品，用均质器制成鳕鱼匀浆，人工污染10 CFU/mL～106CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌活菌，同时加入105CFU/mL单李死菌，用PMA处理之后，在优化条件下进行PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测。

2　结果与讨论

2.1最佳PMA浓度的选择

PMA浓度的优化结果见图1。

图1　PMA浓度的优化Fig.1　Optimization of PMA concentration

随着PMA浓度的增大，死菌DNA qPCR扩增的CT值明显升高，当PMA浓度超过5.0 μg/mL时，反应体系的CT值几乎不再发生变化。）当PMA浓度超过10.0 μg/mL时，活菌DNA qPCR扩增的CT值略微高于不加PMA的对照组，可能高浓度PMA影响了活菌DNA的qPCR扩增。本研究选用5.0 μg/mL作为最佳浓度。

2.2最佳曝光时间的选择

曝光时间的优化见图2。

图2　曝光时间对PMA处理死细胞的影响Fig.2　Optimization of exposure time

随着光照时间的增加，体系的循环数（CT值）迅速升高，光照时间超过15.0 min后，体系的CT值不发生明显变化，本研究选取15.0 min作为最佳曝光时间。

2.3qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的线性曲线

利用qPCR进行单核细胞增生李斯特氏菌的检测。qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的线性曲线见图3。

图3　单核细胞增生李斯特氏菌qPCR标准曲线Fig.3　Standard curve of qPCR

CT值与单核细胞增生李斯特氏菌的浓度在102CFU/mL～108CFU/mL范围内呈现良好的线性关系（R=0.998 5），其线性回归方程为：y=44.01-3.38x，方程中y代表DNA qPCR扩增的CT值，x代表单核细胞增生李斯特氏菌的浓度对数值。

2.4qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测不同比例活菌的比较

对活菌比例为0%、10%、25%、50%、100%的单核细胞增生李斯特氏菌菌液进行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测，见图4。

图4　对不同比例活死菌混合液的检测Fig.4　Detection of different proportion of living dead bacteria mixture

如图4所示，不论活菌比例如何变化，qPCR检测结果为活菌与灭活菌的总量；当活菌比例0%时，PMA-qPCR、PMA-ddPCR未检出单核细胞增生李斯特氏菌，说明PMA抑制了热灭活菌的DNA扩增，避免了假阳性；随着活菌比例的增加，PMA-qPCR和PMA-ddPCR测得浓度值随之升高，但是PMA-ddPCR检出结果与平板计数结果更加靠近，由于PMA-ddPCR把样本分成上万个微滴，增加了检测结果的准确度。

2.5PMA-ddPCR、PMA-qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度

图5　PMA-ddPCR、PMA-qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度Fig.5　Sensitivity of Listeria monocytogenes by PMA-ddPCR and PMA-qPCR detection

将1.7×106CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌菌液10倍梯度稀释，分别标记为L6～L1，进行PMA-ddPCR、PMA-qPCR检测。PMA-ddPCR所有反应生成的微滴数目均大于10 000（图5A），表明所有反应微滴生成正常，保证了后续定量分析的准确性。从一维散点图（图5B）上可以看出L1至L6生成的阳性微滴数分布，阳性微滴数目随着浓度的升高而逐渐增多。此外，阴性对照（NTC）中没有检测到阳性微滴，可见该体系中没有污染或非特异性扩增，PMA-ddPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌有良好的特异性。PMA-ddPCR灵敏度是2copy/20μL，并在2copy/20μL～1.99×104copy/ 20 μL呈良好的线性（R=0.999 1）（图5C）。PMA-qPCR最少可检出102CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌（图5D），将L1～L6测得CT值代入2.3标准曲线计算浓度值作图，PMA-qPCR线性相关系数R=0.996 8。PMA-ddPCR线性优于PMA-qPCR。

2.6PMA-ddPCR检测人工污染样品中单核细胞增生李斯特氏菌

在热灭活菌存在的情况下，对不同污染程度的鳕鱼样品进行PMA-qPCR、PMA-ddPCR检测，如图6所示。

图6　检测人工污染样本中单核细胞增生李斯特氏菌Fig.6　Detection of Listeria monocytogenes in artificial pollution test samples

PMA-ddPCR检测人工染菌鳕鱼样品，最低可检出102CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌，且与理论添加值基本吻合。当染菌量≤103CFU/mL时，PMA-qPCR测得值与理论添加值偏差较大。PMA-ddPCR检测低浓度染菌样品时优于PMA-qPCR。PMA-ddPCR对样品检测的RSD均小于5.0%，精确度、稳定性良好。

3　结论

PMA与ddPCR相结合的方法，可以在热灭活菌存在的条件下定量检测单核细胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假阳性”结果的出现，PMA-ddPCR方法整个过程不足2 h，成功检测鳕鱼样品中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的含量。与PMA-qPCR方法相比，具有灵敏度高，检测限底，精密度高等优点。PMA-ddPCR方法具有巨大的发展空间，有望应用于其他样品的检测。

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Detection of Live Listeria monocytogenes by PMA-ddPCR

WANG Jing1，CUI Feng-jie1，QIN Yan1，JIA Jun-tao2，WEI Wei1，ZHANG Hui-min1
（1.Inspection and Quarantine Technology Center of Weihai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai 264205，Shandong，China；2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao
266500，Shandong，China）

A method to detect living cells of Listeria monocytogenes was developed based on propidium monoazide（PMA）and ddPCR.The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 5.0 μg/mL and exposure of 15 min could restrain DNA amplification of 105CFU/mL dead cells，and the maximum PMA against DNA amplification from live Listeria monocytogenes cells was 10.0 μg/mL.Only live Listeria monocytogenes cells was detected by PMA-ddPCR even in the existence of dead Listeria monocytogenes.The detection limit was 2.0 copy/20 μL.PMA-ddPCR could detect 102CFU/mL Listeria monocytogenes in the codfish polluted by manual work.Furthermore，PMA-ddPCR showed better accuracy and stability.

propidium monoazide；ddPCR；Listeria monocytogenes；live cells

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.026

国家质检总局科技计划项目（2014IK114）

王静（1975—），女（汉），高级工程师，硕士研究生，研究方向：食品安全与检测。

2015-10-01