金钗石斛多糖提取工艺研究

余芳，郑萍，哈清，汪洪涛，蒋彩云

（江苏经贸职业技术学院食品系，江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏南京211168）

金钗石斛多糖提取工艺研究

余芳，郑萍，哈清，汪洪涛，蒋彩云

（江苏经贸职业技术学院食品系，江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏南京211168）

以金钗石斛为原料，经粉碎、脱脂、打浆和超声波破壁等处理后采取水提取法，通过单因素和正交试验试验，研究了水提温度、超声波时间、水提时间、料液比对超声辅助提取金钗石斛中多糖的影响。结果表明，影响金钗石斛多糖提取因素的主次关系为：料液比>超声波时间>水提温度>水提时间，金钗石斛多糖提取的最佳条件为：料液比1∶25（g/mL）、超声波时间40min、水提时间120min、水提温度80℃。

金钗石斛；多糖；超声辅助提取；正交试验

金钗石斛是《中国药典》收载的5种石斛之一，为我国传统名贵中药，《本草纲目》中记载其“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”，用于治疗热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明等症，具有较高的药用价值。金钗石斛的主要药用成分是石斛碱和多糖［1］，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗菌［2-5］等多种功效。传统经验认为，质重、嚼之粘牙、味甘、无渣者为优品，其多糖含量较高［6］。本文研究了金钗石斛多糖的提取优化工艺，旨在为金钗石斛资源开发利用提供参考。

金钗石斛多糖的提取方法有很多，目前常用的提取方法有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、水提醇沉多糖和酶法。水提法是提取多糖的最常用方法之一，使用较多的是热水浸提。超声提辅助取法主要是利用超声波破坏植物细胞组织，使之变形、破裂并释放出内含物，同时加速植物有效成分在溶剂中的扩散释放，促进植物有效成分与溶剂混合，有利于萃取。叶余原等［7-9］进行了超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究，考察了提取温度、固液比、提取时间和超声频率4个因素对铁皮石斛多糖提取率的影响。在单因素实验的基础上，通过正交试验优化提取工艺，综合确定的优化提取工艺条件为1∶30（g/mL）的料液比，超声波功率300 W，45 kHz超声频率，提取1.5 h，铁皮石斛多糖的平均得率为15.3%，郑斯卓等［10］选定提取温度、提取次数和乙醇最终浓度三个因素研究其对金钗石斛多糖提取率的影响。得到多糖浸提的最佳工艺条件为提取温度为85℃，提取次数为3次，乙醇终浓度为75%。刘文等［11］在单因素试验基础上，以微波频率、料液比、浸提时间、微波时间为正交试验的影响因素，以多糖的提取率为评价指标，对影响石斛多糖提取工艺的因素进行研究。最佳实验条件是为：微波频率为1 470 MHz，料液比1∶30（g/mL），浸提时间3 h微波时间10 min。在此条件下，金钗石斛粗多糖得率为4.23%。

我国药用植物资源十分丰富，是药物研发的源泉［12］。近几年来，金钗石斛多糖以其独特的作用成为近年来研究的重点。因此，开展金钗石斛多糖的提取分离纯化工艺研究，为多糖的医疗保健功能开发提供理论依据。目前，金钗石斛多糖分离纯化还处于小批量实验室阶段，而规模化的提取、精制、纯化及其应用开发等都需要深入的研究。

1　材料与方法

1.1材料及试剂

金钗石斛：产自贵州遵义。

浓硫酸、苯酚、石油醚、无水乙醇、三氯乙酸、葡萄糖等试剂皆为国产分析纯。

1.2仪器及设备

KJ-TBL-5A低速台式大容量离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；JY98-ШDN超声波细胞粉碎机：宁波超声波设备有限公司；KQ-500E型超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司；SZ-1型快速混匀器：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；722S可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；DGF30/23-ⅢA型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-5203旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3方法

1.3.1标准曲线制作

称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖100.0 mg，置100 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，每毫升含葡萄糖0.1 mg。分别精密取溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置于具塞试管中，分别加水至2.0mL，各加入5%苯酚溶液1.0mL摇匀，迅速加入硫酸5.0 mL摇匀，放置10 min，置沸水浴中加热15 min，取出迅速冷却至室温，紫外分光光度计490 nm波长处测定吸光度，空白对照以2.0 mL蒸馏水代替葡萄糖溶液。以吸光度（X）为横坐标、浓度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2金钗石斛粗多糖制备

新鲜的金钗石斛洗净→粉碎→脱脂→打浆→超声波细胞粉碎→超声辅助提取→热水浸提→冷却→离心→取上清液（苯酚-硫酸法测定多糖含量）→上清液真空浓缩至1/3→加入3%的三氯乙酸溶液→摇匀→静置→离心→得蛋白沉淀和多糖溶液→多糖溶液→加无水乙醇→摇匀→静置→离心→烘干沉淀→金钗石斛多糖

1.3.3金钗石斛中多糖提取单因素试验

准确称取金钗石斛粉末2 g，加水打浆后超声破壁处理2 min（作用时间2 s，间歇时间3 s）。通过单因素试验，考察超声波时间、水提温度、水提时间、料液比对金钗石斛多糖含量的影响，采用苯酚-硫酸法［13］测定金钗石斛多糖含量。

1.3.3.1水提温度

设定水提温度50、60、70、80、90℃，超声波功率200 W，浸提120 min，料液比1∶30（g/mL），超声波时间40 min，测定金钗石斛多糖含量。

1.3.3.2水提时间

按照料液比1∶30（g/mL），超声波功率200 W，温度60℃，超声波时间40 min，浸提时间设定90、120、150、180、210 min，测定金钗石斛多糖含量。

1.3.3.3超声波时间

设定超声波时间20、30、40、50、60 min，料液比1∶30（g/mL），超声波功率200 W，温度为60℃，浸提120 min，测定金钗石斛多糖含量。

1.3.3.4料液比

按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），超声波时间40 min，超声波功率200 W，温度60℃，浸提120 min，测定金钗石斛多糖含量。

1.3.4金钗石斛多糖提取工艺正交试验

在单因素试验的基础上，以料液比、超声波时间、水提时间及水提温度作为4个考察因素，选取3个水平进行试验。采用L9（34）正交表进行正交试验设计，来确定提取最佳工艺。

表1　金钗石斛多糖提取因素水平表Table 1　Levels and factors of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　Glucose standard curve

葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.340 6x-0.002 2（x为葡萄糖浓度，y为吸光度），线性相关系数为：R2= 0.999 1。金钗石斛多糖溶液在此浓度范围内，与吸光度呈良好的线性关系。当测定多糖含量时，将所测定得到的吸光度代入葡萄糖标准曲线回归方程，即能够计算出所测溶液的多糖含量。

2.2提取条件对得率的影响

2.2.1超声提取时间对得率的影响

超声提取时间对得率的影响见图2。

图2　超声提取时间对多糖含量的影响Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on polysaccharides content

由图2可知，使用超声波进行辅助提取与未使用相比，多糖含量明显提高；随着超声时间的增加，多糖含量呈先上升后平稳趋势。超声时间在30 min至50 min范围内，多糖含量较为稳定，当超声时间为40 min时，多糖含量最高，达到最大值。李金忠等［14］对超声辅助提取山药多糖进行研究，该工艺与传统水提法工艺相比，山药多糖得率提高了2倍多，同时大大缩短了提取时间。

2.2.2水提温度对得率的影响

水提温度对得率的影响见图3。

图3　水提温度对得率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides content

图3的结果表明，在50℃至80℃范围内，金钗石斛多糖的得率随着温度的升高呈现上升趋势，得率不断增大。这是因为溶液的溶解度随着温度增加不断增大。在80℃之后，金钗石斛多糖的得率随着温度的升高呈下降趋势，得率不断降低，因而选择70、80、90℃作为正交试验的3个试验水平。

2.2.3水提时间对得率的影响

水提时间对得率的影响见图4。

图4　水提时间对得率的影响Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides content

由图4可知，超声辅助提取后水提时间在前90 min～150 min内，随着提取时间的延长，金钗石斛中多糖的得率随之升高，150 min末接近最大值，可见反应时间越长，提取越充分。在150 min～210 min，金钗石斛多糖得率下降。因此，选择水提时间120、150、180 min作为正交试验的3个水平。

2.2.4料液比对得率的影响

料液比对得率的影响见图5。

图5　料液比对得率的影响Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content

由图5的结果可知，料液比由1∶20（g/mL）到1∶30（g/mL），多糖得率逐渐增大。当料液比为1∶30（g/ mL）时得率达到5.913%，之后，随着液体的增多，多糖得率也逐步下降。料液比为1∶40（g/mL）时，多糖得率为4.445%。因此，选择1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）作为正交试验的3个水平。

2.3正交试验

正交试验结果见表2。

表2　正交试验结果Table 2　Result of the orthogonal experiment

续表2 正交试验结果Continue table 2　Result of the orthogonal experiment

根据单因素试验的结果，选取影响金钗石斛多糖提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用L9（34）正交表，以超声波时间（A）、水提温度（B）、水提时间（C）、料液比（D）作为4个考察因素，选取3个水平进行试验。每一水平K1、K2、K3中最大的值所对应的条件即为该因素对应的最佳提取条件。由表2可以看出提取金钗石斛多糖的最佳条件为A2B2C1D1，即超声波辅助提取后水提温度80℃、超声波时间40 min、超声波辅助提取后水提时间120 min、料液比1∶25（g/mL）。4个因素对金钗石斛多糖得率的影响大小依次为：D>A>B> C，其中料液比D的提取作用最为显著。利用最佳的提取条件，进行重复试验可使多糖平均得率达到6.945%。

3　结论

采用超声波辅助水浸提金钗石斛多糖，通过单因素试验和正交试验结果分析可得出金钗石斛多糖提取最优工艺：超声波时间40 min，水提时间120 min，水提温度80℃，料液比1∶25（g/mL）。

利用超声辅助提取方法，极大程度地缩短了水提时间，并且得到了较高的得率。利用最佳的提取条件，进行重复试验可使多糖平均得率达到6.945%。

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Study on the Extraction of Dendrobium nobile Lindl Polysaccharide

YU Fang，ZHENG Ping，HA Qing，WANG Hong-tao，JIANG Cai-yun
（College of Food，Jiangsu Institute of Economic＆Trade Technology，Research and Development Center of Food Safety Engineering Technology，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

Dendrobium nobile Lindl was used as raw material after crushing，degreasing，beating，ultrasonic wall-breaking and extracted in water，the effects of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction on single factor as water extraction temperature，ultrasonic time，water extraction time and solid-liquid ratio on ultrasonic assisted extraction were studied.By orthogonal test，the analysis influences Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction of primary and secondary relations of factors were as follows：material liquid ratio> ultrasonic time>water extraction temperature>water extraction time.The results showed that the best conditions for：material liquid ratio 1∶25（g/mL），ultrasonic time 40 min，water extraction time 120 min and water extraction temperature 80℃，and the influence of material liquid ratio on Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction yield was the most significant.

Dendrobium nobile Lindl；polysaccharide；ultrasonic assisted extraction；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.011

江苏省青蓝工程资助，江苏经贸职业技术学院院级课题（JSJM1410）

余芳（1970—），女（汉），教授，博士，研究方向：食品营养与安全。

2015-12-24